Flash NanoPrecipitation (FNP) er en skalerbar tilgang til at producere polymere core-shell nanopartikler. Lab-skala formuleringer for indkapsling af hydrofobe eller hydrofile therapeutics er beskrevet.
Formulering af et terapeutisk sammensatte til nanopartikler (NPs) kan give unikke egenskaber. For dårligt vandopløselige stoffer, kan NP formuleringer forbedre biotilgængelighed og ændre narkotika distribution i kroppen. For hydrofile stoffer som peptider eller proteiner giver indkapsling inden for NPs også beskyttelse mod naturlige clearance mekanismer. Der er nogle teknikker til produktion af polymert NPs, der er skalerbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) er en proces, der bruger manipuleret blanding geometrier til at producere NPs med smalle størrelse distributioner og afstemmelige størrelser mellem 30 og 400 nm. Denne protokol indeholder instruktioner om laboratorium-skala produktion af kerne-shell polymere nanopartikler af target størrelse ved hjælp af FNP. Protokollen kan gennemføres for at indkapsle enten hydrofile eller hydrofobe forbindelser med kun mindre ændringer. Teknikken kan let ansat i laboratoriet på milligram skala til skærmen formuleringer. Bly hits kan direkte skaleres op til gram – og kilogram-skala. Som en kontinuerlig proces indebærer skala-up længere blanding køre procestid snarere end oversættelse til nye proces fartøjer. NPs produceret af FNP er højt læsset med terapeutiske, indslag en tætte stabiliserende polymer pensel, og har en størrelse reproducerbarhed ± 6%.
Siden slutningen af 1990 ‘ erne, har der været en støt stigning i antallet af kliniske forsøg med nanomaterialer1,2. Den stigende interesse afspejler løfte om nanomaterialer at forbedre biotilgængelighed af hydrofobe narkotika og aktivere præferentielle målretning i kroppen3. Polymere nanopartikler (refereret til som nanopartikler eller NPs her) udgør en voksende del af denne klasse af materialer2. NPs har høstet interesse, fordi de har meget afstemmelige egenskaber som størrelse, sammensætning og overflade functionalization4. Når den anvendes til administration af tungtopløselige stoffer, har NPs ofte en kerne-shell struktur hvor den terapeutiske er indkapslet i den hydrofobe kernen og skallen består af en hydrofil polymer pensel. En enkel måde at generere denne struktur beskæftiger en amphiphilic diblock copolymer (BCP) bestående af en nedbrydeligt hydrofobe blok, der indgår i partikel-core, og en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blok, der udgør polymer pensel og formidler sterisk stabilisering4,5.
Nanoprecipitation er en fælles fabrikation teknik for polymere nanopartikler, fordi det er simpelt og ikke energi intensive6. I sin enkleste form indebærer nanoprecipitation tilsætning af pipette af NP komponenter i et organisk opløsningsmiddel som acetone til en overskydende mængde stirred vand. Ændringen i opløsningsmiddel til en fortyndet vandig opløsning medfører udfældning af uopløselige kernekomponent. Stabilisatoren samler på denne voksende partikel overflade, instrueret af adsorptionen af kollapsede hydrofobe blok7,8,9,10. En ensartet partikelstørrelsesfordeling opnås når opløsningsmiddel og vand hurtigt blandes til at danne en homogen opløsning. Blanding, er langsommere end Nukleering og samling af komponenter resulterer i en større, mere polydisperse partikel befolkning. Selvom let tilgængelige for en enkel test, stirred batch tilgang resultater i bred variation på grund af blande inkonsekvens og er ikke indstillet til opskalering6,11. Mikrofluidik er dukket op som en anden avenue til NP produktion, der kan køre kontinuerligt. Denne form for produktion har været for nylig gennemgået af Ding et al. 11 . En fælles tilgang bruger laminar flow med fokus for at reducere opløsningsmiddel længde skala til sub micron værdier. Blanding af antisolvent sker ved diffusion, så små flow dimensioner er afgørende for at sikre ensartede partikler11,12. Parallelization af flere mikrofluid kamre for skala-up er problematisk for store produktionsmængder.
De hurtige blanding forhold, der favoriserer ensartet nanoprecipitation i mikrofluidik kan skiftevis fremstilles i begrænset, turbulent strømme. Flash NanoPrecipitation (FNP) beskæftiger særlige blanding geometrier til at opnå disse betingelser højere volumetriske flowhastighed end muligt med mikrofluidik. Indløb streams Angiv et blandingskammer under turbulente forhold, der fører til generation af hvirvler, således at opløsningsmiddel/anti-solvent lamellae danner på længde omfanget af diffusion11,13. Dermed, ensartet blanding på en kortere end Nukleering og væksten i den terapeutiske tidsskala er opnået. Mixeren begrænset geometri tillader ikke stream omgåelse af regionen hvor turbulente energi varmeafledning opstår og hele systemet oplever den samme proces historie13. Nukleering sker ensartet i blandingskammeret og partikel vækst fortsætter indtil stoppet af forsamlingen af BCP på overfladen9,14. Den blandede stream indeholdende stabil partikler kan derefter fortyndes med yderligere antisolvent at undertrykke Ostwald modning af partikler15,16,17.
En begrænset aktiverende jet (CIJ) mixer er den enkleste mixer design for FNP og tillader blanding af to strømme i en skalerbar og kontinuerlig måde, som vist i figur 1A13. En multi inlet vortex mixer (MIVM) blev udviklet for at aktivere op til fire forskellige strøm indgange samtidig stadig opnå den hurtige micromixing kræves til ensartet partikel dannelse, som vist i figur 1B18. FNP muliggør enkel formulering screening, der kan let oversættes til kommerciel-skala produktion. På grund af processen kontinuerlig karakter kræver større parti størrelser ikke nye fartøjer, men snarere længere køre gange, muliggør enkel oversættelse til kilogram-skala produktion i samme udstyr toget.
Hydrofile forbindelser såsom peptider og proteiner (‘biologics’) kan også være indkapslet i en proces kaldet inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). Teknikken kræver en amphiphilic BCP hvor én blok er hydrofobe og den anden er en polyacid19. Det første skridt indebærer hurtig sammenblanding af en dimethyl sulfoxid (DMSO) stream indeholdende den biologiske og BCP mod en lipofile opløsningsmiddel som dichlormethan eller chloroform. Dette resulterer i dannelse af partikler stabiliseret med hydrofobe blok pensel. Sådan en arkitektur vil her, betegnes som en ‘omvendt’ NP. Kernen indeholder polyacid, som er så ionically crosslinked ved hjælp af en multivalente kationer. Det stabiliserer partikler til forarbejdning til et vandigt miljø i form af mikropartikler eller PIND-belagt nanopartikler af teknikker, der har været rapporteret i litteraturen19,20,21.
Denne protokol kan anvendes til lab-skala produktion af polymert core-shell nanopartikler indkapsling enten hydrofobe eller hydrofile forbindelser. Undersektioner af protokollen giver anvisninger på brugen af begge mixer klasser – CIJ og MIVM. Læseren bør kunne tilpasse protokollen for romanen kernekomponenter og reproducerbar generere nanopartikler af ønskede størrelse ved hjælp af passende mixeren for strøm indgange. Tre eksempel formuleringer ved hjælp af FNP og iFNP præsenteres nedenfor. To ansætte CIJ mixer og kræver en MIVM15,22. Den første formulering viser indkapsling af en model hydrofobe sammensatte af FNP. Den anden formulering viser indkapsling af en model hydrofile sammensatte af iFNP i en CIJ mixer. Den endelige formulering giver et eksempel på protein indkapsling af iFNP ved hjælp af en MIVM. Protokol for denne tredje formulering beskriver brugen af små, håndholdte MIVM betegnes ‘μMIVM.’ Mixer design er mindre at give mulighed for forenklede formulering screening, men funktionen skalering er velbeskrevet og mixeren er ikke en mikrofluid enhed22. I det sidste afsnit af protokollen indeholder nogle noter på skala-up af bly formuleringer identificeret i screening. Disse formuleringer er beregnet til at give adgangspunkter for den læringsproces og derfor bruge ikke-nedbrydelige poly (styren)-baserede polymerer. Alternative stabilisatorer er blevet beskrevet i litteraturen, med en række biokompatible kommercielle indstillinger tilgængelige14,23,24.
Indkapsling af hydrofobe forbindelser, såsom vitamin E, som i trin 1 i protokollen, har været udførligt beskrevet9,14,28. Relativt er monodisperse partikler produceret for tidshorisonten for blanding er kortere end tidshorisonten for sammenlægning og vækst af partikler. Specifikt bliver blandet opløsningsmiddel/antisolvent løsningen hurtigt homogen, som gør det muligt for Nukleering at forekomme ensartet. Montering af blokcopolymer partikel overflade derefter giver sterisk stabilisering, der stopper partikel vækst5. Da blande tid i salen (turbulens) er en funktion af strømningshastigheder indløb til CIJ eller MIVM, er der et indløb sats, som opstår efter overgangen til turbulent blanding, hvor partikelstørrelse er stort set konstant13. Dette giver yderligere robusthed over for processen som en batch til batch variation i inlet flowhastighed (dvs., sprøjte depression hastighed) kan tolereres uden betydning for den endelige NP størrelse, som det ses af figur 3. Langsommere eller ujævn inlet hastigheder kan resultere i større partikler eller mere polydisperse distributioner, som det ses f.eks fejltænding. Nummerportabilitet er også blevet udvidet for at indkapsle hydrofile forbindelser i nanopartikler af inverse Flash NanoPrecipitation. Disse inverteret nanopartikler kan derefter bruges til at oprette mikropartikler eller være beklædt med PIND til at skabe vand-spredbar nanopartikler25. De underliggende forsamling principper forblive den samme, selv om der er den ekstra kompleksitet af crosslinking partikel core. Dette er nødvendigt for stabilisering af partikel i et vandigt miljø. I almindelighed, er forholdet 1:1 beregning i forhold til polyacid blokken tilstrækkelig, selvom de Ioniske interaktioner kan fremmes ved justering af pH gennem tilsætning af en base19. I denne protokol, er blevet beskrevet kun den første proces skridt til form inverteret NPs.
Ud over hurtig blanding er vellykket formulering af FNP eller iFNP begrænset til tilfælde, hvor flere betingelser kan være mødte9,14. Første, alle strøm indgange skal være blandbar. Mens emulsioner har været brugt til at producere NPs, kræver FNP en ensartet løsning fase i mixeren. For det andet skal den kernekomponent næsten uopløselige i opløsningsmiddel betingelserne i mixer (for CIJ, en 50/50 blanding af volumen) at køre hurtig Nukleering. Ellers, en betydelig del forbliver unencapsulated eller vil bundfald efter yderligere fortynding med antisolvent. MIVM kan aktivere højere antisolvent indhold i blandekammeret adresse core materiale opløselighed begrænsninger. Det er ofte nyttigt at generere supersaturation kurver fra opløselighed data som en funktion af opløsningsmiddel sammensætning til at guide proces design9. Figur 6 viser repræsentative kurver for to forbindelser. Lav supersaturation på de blanding kammer betingelser fortjenester opererer på forskellige kompositioner, typisk ved hjælp af MIVM. Højere supersaturation favoriserer Nukleering af den kernekomponent over partikel vækst men en uoverensstemmelse i forsamlingen tid af kernemateriale og stabilisator kan resultere i store aggregater af den terapeutiske. D’Addio og Prud’homme har gennemgået anvendelsen af sådanne supersaturation kurver i detalje9. Endelig, BCP molekylemæssigt skal opløses i det opløsningsmiddel stream og antisolvent streamen skal være selektiv for én blok. BCP skal være tilstrækkelig amphiphilic til at give både en solvophobic drivkraft fra kollapsede blokken til at forankre stabilisator på partikel overflade og til solvated blok at give sterisk stabilitet til partikel. Opløsningsmidler ikke er beskrevet i protokollen kan anvendes, så længe de opfylder disse betingelser.
Praksis med manuel sprøjte operation kan forbedre succesraten under screening. Som nævnt ovenfor, betyder drift over overgangen til homogen, turbulent blanding betingelser at små variationer i strømningshastigheden er tolereret i processen28. Skala-up til pumpe-drevne, computer-kontrollerede strømme medfører endnu større gevinster i sammenhæng på grund af reproducerbare inlet strømningshastigheder. På ethvert tidspunkt under efterbehandling af partikler, kan visuel inspektion eller DLS analyse indikere tilstedeværelsen af store aggregater, der kan være på grund af hændelige støv eller partikel ustabilitet. Når det er nødvendigt, kan streamen filtreres med en passende filter porestørrelse. I mangel af aggregater, vi har konstateret, at mindre end 5% masse er typisk tabt, når filtrering PIND-belagt nanopartikler, hvis nominelle filter størrelse er større end partikelstørrelsesfordeling. Når filtrering aggregater, er eksperimentel bestemmelse af masse tabt under processen nødvendig. Kvantificering af massetabet kan foretages på to måder. Tørvægt i en given mængde kan bestemmes massen af thermogravimetric analyse før og efter filtrering til at identificere omfanget af forandringer (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Alternativt, partikler kan være genvundet (f.eks.af ingot) og opløst i et godt opløsningsmiddel. Koncentrationen af kernemateriale kan derefter direkte måles ved en passende teknik såsom ultraviolet-synlige spektrofotometri eller kromatografi.
For FNP, skal de resterende 10 vol % organisk opløsningsmiddel (fxTHF) fjernes fra den vandig dispersion. Dette kan gøres ved fordampning destillation14,29, dialyse30eller tangential flow filtrering31,32. Praktiske overvejelser for hver behandlingstrin er beskrevet i henvisningerne forudsat. Dialyse er typisk membraner 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, selvom der findes større muligheder. Denne molekylvægt cutoff er tilstrækkelig for solvent fjernelse når dialysebehandling i 24 timer ved hjælp af flere bad ændringer. Brugen af tangential flow filtrering indebærer nogle procesudvikling som skal sørges for at undgå inducerende aggregering på grund af koncentrationen polarisering på membranen overflade. Vi har fundet, at reducere de organiske opløsningsmidler sammensætning under et system-afhængige værdi, normalt 2-10 vol %, eliminerer aggregering på membranen overflade. Efter forarbejdning, bestemmes koncentrationen af nanopartikler let ved thermogravimetric analyse (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Det er ofte ønskeligt at transportere eller opbevare partikler i en yderst stabil form. Vandige dispersioner kan simpelthen være frosset hurtigt ved hjælp af en tør is/acetone blanding og derefter opbevares ved-80 ° C. Alternativt, tørt pulver kan opnås ved ingot33,34 eller spray tørring24. Ofte, skal en kryoprotektant føjes til reducere nanopartikel sammenlægning under frysning eller tørring. Sukker (saccharose, trehalose, osv.), poly(ethylene glycol) eller cyclodextrins kan screenes for effektiviteten over en række koncentrationer af overvågning størrelse af DLS35,36,37, 38. Fælles NP stabilitetsproblemer under behandling er ofte relateret til opløselighed eller fase adskillelse i kernen resulterer i omlejring mod et lavere energi stat på betingelser, hvor mobilitet er øget. Brug af fælles kerne materialer, alternative stabilisatorer eller modificerede eksterne løsning sammensætning kan bidrage til at forbedre stabiliteten14,16,17,39,40, 41.
Som nævnt ovenfor, MIVM giver mulighed for højere antisolvent indhold i blandekammeret når kræves for at opnå høj supersaturation. Det kan også give mulighed for den fysiske adskillelse af arter i mere end to vandløb når reaktivitet eller opløselighed begrænsninger kræver det. Et eksempel er dannelsen af zein protein-stabiliseret nanopartikler af antibiotika clofazimine24. Den hydrofobe clofazimine er indført i en acetone stream; Trine er indført i en 60% ethanoliske vandig strøm; kasein, som komplekser med zein, er bragt ind med en vandig buffer stream, og den fjerde stream er ekstra buffer til at øge forholdet mellem vand til acetone og ethanol. To opløsningsmiddel vandløb er påkrævet, da clofazimine og zein ikke er opløselig i et fælles opløsningsmiddel. Denne proces kan ikke ske i en to-jet CIJ mixer. Dette protein-stabiliseret formulering viser også, at Nummerportabilitet ikke er begrænset til BCP stabilisatorer. Janus partikler er produceret uden stabilisator42 og et sortiment af lavprisselskaber stabilisatorer er blevet påvist til mundtlige ansøgninger24. Navnlig, kan copolymerer såsom hydroxypropyl methylcellulose bruges i stedet for blok copolymerer af24. Core materialer kan gøres mere hydrofobe ved en række teknikker. Hydrofobe ion parring er blevet anvendt til at indkapsle en bred vifte af forbindelser, der har mellemliggende opløselighed43,44,45. Ekstremt hydrofob prodrugs er blevet genereret og derefter indkapslet46. Nukleinsyrer har været indkapslet gennem kompleks med kationiske lipider47. Vigtigere, har disse undersøgelser vist, at Nummerportabilitet kan producere en række partikel overflade kemi. Yderligere, blandet stabilisatorer indeholdende en brøkdel af BCP, der er blevet ændret med en målretning ligand på kæde ende har været brugt. Dette giver præcis kontrol over ligand indhold på overfladen, da partiklen sammensætning afspejler Inputstreamen sammensætning23,48. Tilsvarende er det muligt at inkorporere flere kernekomponenter, herunder farvestoffer og uorganiske nanopartikler3,8.
Flash NanoPrecipitation er en skalerbar tilgang til polymere nanopartikler består af enten en hydrofobe eller en hydrofil kerne. Hvis de kriterier, der er opregnet ovenfor er opfyldt, er generelt over 95% af kernemateriale indkapslet på høj massefraktionen i partikel. De tre eksempler, her blev udført på bænken skala, der kræver et par milligram af materiale og ca. 0,5 mL i hver inlet stream. Dette giver mulighed for hurtig screening af partikel betingelser for formulering optimering. Opskalering af bly formuleringer til større parti størrelser er en sag af løb den oparbejde i længere tid, der kan let ske ved hjælp af sprøjte pumper eller Strømningsregulatorer. Derimod ansigter opskalering af bulk tilsætning nanoprecipitation veldokumenterede udfordringer i at opretholde tilstrækkelig micromixing på tilsætning og tegner sig for effekten af at ændre fartøj geometri49. Dette er en væsentlig hindring, da det er afgørende at fremstille partikler på en ensartet måde at møde FDA krav50. Mikrofluidik teknikker kan også producere ensartet, reproducerbare nanopartikler, men kun aktiverer produktionen i området milligram. For eksempel, rapporterede Karnik et al. produktion satser på 0,25 mg/min. for en drug udgivelse studere51. Yderligere skala-up indebærer typisk parallelization ved høj kapital koste12. Med FNP er det ligetil at producere 1 gram af nanopartikler 600 mg/min. med en sprøjten pumpe og et par beslag til at forbinde til mixeren fjorde. Derfor repræsenterer FNP både en tilgængelig lab-skala screeningsværktøj samt en skalerbar tilgang til NP produktion for Translationel arbejde.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), af Bill og Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) og den National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tildeles K.D.R.
Confined Impinging Jets Mixer | NA | NA | See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation |
Luer fitting | Idex Health & Science | P-604 | Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads |
Plug fitting | Idex Health & Science | P-309 | Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling) |
Outlet fitting – CIJ | Idex Health & Science | P-205 | Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet |
Outlet ferrule – CIJ | Idex Health & Science | P-200 | Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing) |
Outlet tubing – CIJ | Idex Health & Science | 1517 | Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher Scientific | T425-4 | Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications. |
Norm-ject syringe (3 ml) | VWR | 53548-017 | |
Vitamin E (α-tocopherol) | Sigma-Aldrich | 90669-50G-F | Store cold |
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k | Polymer Source | P13141-SEO | Other block sizes acceptable depending on application |
poly(styrene)1.8k | Polymer Source | P2275-S | Example hydrophobic core material |
Scintillation vial | DWK Lifesciences | 74504-20 | |
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) | National | S7510-1 | |
Maltodextrin DE 4-7 | Sigma-Aldrich | 419672-100G | |
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k | Polymer Source | P5917-SAA | Other block sizes acceptable depending on application |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D159-4 | |
Calcium chloride dihdyrate | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Hygroscopic. |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) | Sigma-Aldrich | A5503-1G | |
Multi-Inlet Vortex Mixer | NA | NA | See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation |
Outlet fitting – MIVM | Idex Health & Science | P-942 | Combination with ferrule |
Outlet tubing – MIVM | NA | NA | Fit to ferrule ID. |
O-ring (MIVM) | C.E. Conover | MM1.5 35.50 V75 | Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source. |
Mixer stand | NA | NA | See Markwalter & Prud'homme for design.17 |