Flash NanoPrecipitation (FNP) är en skalbar metod att producera polymera core-shell nanopartiklar. Lab-skala formuleringar för inkapsling av hydrofoba eller hydrofila therapeutics beskrivs.
Utformningen av en terapeutisk förening till nanopartiklar (NPs) kan ge unika egenskaper. För dåligt vattenlösligt läkemedel, kan NP formuleringar förbättra biotillgänglighet och ändra narkotika distribution i kroppen. För hydrofil droger som peptider eller proteiner, kan inkapsling inom NPs också ge skydd från naturliga clearance mekanismer. Det finns några tekniker för produktion av Polymera NPs som är skalbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) är en process som använder konstruerad blandande geometrier för att producera NPs med smala storlek distributioner och avstämbara storlekar mellan 30 och 400 nm. Detta protokoll ger instruktioner på laboratorieskala produktionen av core-shell polymera nanopartiklar av en Målstorlek som använder FNP. Protokollet kan genomföras för att kapsla in antingen hydrofil eller hydrofoba föreningar med endast smärre ändringar. Tekniken kan användas lätt i laboratorium vid milligram skala till skärmen formuleringar. Bly träffar kan direkt skalas upp till gram och kilo-skala. Som en kontinuerlig process innebär skala upp längre blandning processen körs tid snarare än översättning till nya Processkärl. NPs produceras av FNP är mycket laddade med terapeutiska, har en tät stabiliserande polymeren borste, och en storlek reproducerbarhet ± 6%.
Sedan slutet av 1990, har det varit en stadig ökning av antalet kliniska prövningar som sysselsätter nanomaterial1,2. Det stigande intresset återspeglar löftet om nanomaterial att förbättra biotillgängligheten av hydrofoba droger och möjliggöra förmånsbehandling inriktning inom kropp3. Polymera nanopartiklar (kallas nanopartiklar eller NPs här) utgör en växande andel av denna klass av material2. NPs har rönt intresse eftersom de har mycket avstämbara egenskaper som storlek, sammansättning och ytan funktionalisering4. När tillämpas på förvaltningen av svårlösliga läkemedel, har NPs ofta en kärna-shell struktur där de terapeutiska är inkapslade i hydrofoba kärnan och skalet består av en hydrofil polymer borste. Ett enkelt sätt att generera denna struktur sysselsätter en amfifila diblock sampolymer (BCP) bestående av nedbrytbar hydrofobisk block, som utgör del av partikel kärnan, och en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blockera, som bildar den polymer borsten och förmedlar sterisk stabilisering4,5.
Nanoprecipitation är en vanlig fabrication teknik för polymera nanopartiklar eftersom det är enkelt och inte energi intensiv6. I sin enklaste form innebär nanoprecipitation tillägg med pipett NP komponenter i ett organiskt lösningsmedel som aceton till en överskottet rörs vatten. Spädningsvätska till en utspädd vattenlösning förändringen resulterar i utfällning av olösliga huvudkomponenten. Stabilisatorn monterar på denna växande partikel yta, regisserad av adsorption av kollapsade hydrofoba block7,8,9,10. En enhetlig partikelstorleksfördelning erhålls när den lösningsmedel och vatten snabbt blanda för att bilda en homogen lösning. Blandning som är långsammare än kärnbildning och montering av komponenter resulterar i en större, mer polydisperse partikel befolkningen. Men lätt åtkomliga för ett enkelt test, metoden rörs batch resulterar i bred variation på grund av blandning inkonsekvens och är inte mottagliga för skala upp6,11. Mikrofluidik har dykt upp som en annan avenue till NP produktion som kan köras kontinuerligt. Detta produktionsmedel har nyligen granskats av Ding o.a. 11 . En gemensam strategi använder laminärt flöde med fokus för att minska skalan lösningsmedel längd till sub micron värden. Blandning av antisolvent sker genom diffusion, så litet flöde dimensioner är avgörande för att säkerställa enhetliga partiklar11,12. Parallelization av flera mikroflödessystem kammare för skala upp är problematiskt för stora tillverkningsvolymer.
De snabba blandning villkor som gynnar enhetliga nanoprecipitation i mikrofluidik kan växelvis produceras i trånga, turbulenta flöden. Flash NanoPrecipitation (FNP) sysselsätter speciella blandning geometrier att uppnå dessa villkor högre volymetrisk flöden än möjligt med mikrofluidik. Inlopp strömmar ange en blandningskammare under turbulenta förhållanden som leder till generation av virvlar, så att vätska/anti-solvent lamellerna bildar på längd skala av diffusion11,13. Således, enhetlig blandning på en tidsskala som är kortare än kärnbildning och tillväxt av den terapeutiska uppnås. Mixern trånga geometri tillåter inte strömma förbi i regionen där turbulenta energiupptagning uppstår och hela systemet upplever samma process historia13. Kärnbildning uppstår enhetligt i blandningskammare och partikel tillväxt fortsätter tills stoppades av montering av BCP-reglerna på den ytan9,14. Den blandad ström som innehåller stabila partiklar kan sedan spädas med ytterligare antisolvent att undertrycka Ostwald mognad av partiklar15,16,17.
En mixer med trånga impinging i jet (CIJ) är den enklaste mixer designen för FNP och tillåter blandning av två strömmar i en skalbar och kontinuerlig mode, som visas i figur 1A13. En multi inlopp vortex mixer (MIVM) utvecklades för att aktivera upp till fyra olika stream ingångar samtidigt fortfarande uppnå den snabba micromixing som krävs för enhetlig partikelbildning, som visas i figur 1B18. FNP möjliggör enkel formulering screening som lätt kan översättas till kommersiell skala produktion. Kontinuerlig pågrund av processen kräver större batchstorlekar inte nya fartyg men snarare längre körtider, möjliggör enkel översättning till kilogram produktion i samma utrustning tåget.
Hydrofil föreningar såsom peptider och proteiner (‘biologics’) kan också vara inkapslade i en process kallas inversen Flash NanoPrecipitation (iFNP). Tekniken kräver en amfifila BCP där ett kvarter är hydrofoba och den andra är en polyacid19. Det första steget innebär snabb blandning av en dimetyl sulfoxid (DMSO) dataström med den biologiska och BCP mot lipofilt lösningsmedel såsom diklormetan eller kloroform. Detta resulterar i bildandet av partiklar stabiliserad med hydrofoba block borsten. Här, benämns sådan arkitektur en ‘omvända’ NP. Kärnan innehåller den polyacid, som sedan ionically tvärbunden med en multivalenta cation. Detta stabiliserar partiklarna för bearbetning till en vattenlösning miljö i form av mikropartiklar eller PEG-belagd nanopartiklar av tekniker som har rapporterats i litteraturen19,20,21.
Detta protokoll kan användas för lab-skala produktion av Polymera core-shell nanopartiklar encapsulating antingen hydrofoba eller hydrofila föreningar. Underavsnitten i protokollet ge instruktioner om användningen av båda mixer klasser – den (CIJ) och MIVM. Läsaren bör kunna anpassa protokollet för romanen kärnkomponenter och reproducibly generera nanopartiklar av önskad storlek med hjälp av lämpliga mixern för stream ingångar. Tre exempel formuleringar använder FNP och iFNP presenteras nedan. Två sysselsätter CIJ mixern och en kräver MIVM15,22. Den första formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofoba sammansatta av FNP. Den andra formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofil förening av iFNP i en CIJ mixer. Den slutliga formuleringen ger ett exempel på protein inkapsling av iFNP med en MIVM. Protokollet för denna tredje formulering beskriver användningen av en småskalig, handhållna MIVM kallas den ‘μMIVM’. Mixer design är mindre att möjliggöra förenklade formulering screening, men beteendet skalning är väl förstådda och mixern är inte en mikroflödessystem enhet22. Den sista delen av protokollet innehåller några anteckningar om uppskalning av bly formuleringar identifieras i screening. Dessa formuleringar är avsedda att ge åtkomstpunkter för lärande processen och följaktligen använda icke-nedbrytbara poly (styren)-baserade polymerer. Alternativa stabilisatorer har beskrivits i litteraturen, med ett antal biokompatibla kommersiella alternativen tillgängliga14,23,24.
Inkapsling av hydrofoba föreningar såsom E-vitamin, som i steg 1 i protokollet, har varit utförligt beskrivna9,14,28. Monodisperse partiklar produceras relativt eftersom tidsskalan för blandning är kortare än tidsskalan för sammanläggning och tillväxt av partiklarna. Specifikt, blandad vätska/antisolvent lösningen blir snabbt homogen, vilket möjliggör kärnbildning inträffa jämnt. Montering av segmentsampolymerer till partikeln ytbehandlar sedan ger sterisk stabilisering som stoppar partikel tillväxt5. Eftersom blandning tid i kammaren (turbulens) är en funktion av flödesvärden inlopp till den (CIJ) eller MIVM, finns det en inlopp takt, som inträffar efter övergången till turbulenta blandning, där partikelstorleken är väsentligen konstant13. Detta ger extra tålighet mot processen som vissa sats till sats variation i inlopp flöde (dvs, spruta depression hastighet) kan tolereras utan betydande inverkan på den slutliga NP-storleken som framgår av figur 3. Långsammare eller ojämn inlopp hastigheter kan leda till större partiklar eller mer polydisperse distributioner, som sett för misständning exempel. FNP har också utvidgats för att kapsla in hydrofil föreningar i nanopartiklar av inversen Flash NanoPrecipitation. Dessa inverterad nanopartiklar kan sedan användas för att skapa mikropartiklar eller vara belagd med PEG att skapa vatten-spridbar nanopartiklar25. De underliggande montering principerna desamma, även om det finns extra komplexiteten av crosslinking partikel kärnan. Detta är nödvändigt för stabilisering av partikeln i en vattenlösning miljö. I allmänhet räcker förhållandet 1:1 kostnad jämfört med polyacid blocket, även om de joniska interaktionerna kan främjas genom pH-justering genom tillägg av en bas19. I detta protokoll, har endast första processteget till formuläret inverterad NPs beskrivits.
Förutom snabb blandning är lyckad formulering av FNP eller iFNP begränsad till fall där flera villkor kan vara mötta9,14. Först, alla strömma ingångar måste vara blandbar. Medan emulsioner har använts för att producera NPs, kräver FNP en enhetlig lösning fas i mixern. Andra måste huvudkomponenten vara nästan olösliga på lösningsmedel villkoren i mixern (för CIJ, en 50/50 blandning av volym) att köra snabb kärnbildning. Annars en betydande del förblir oinkapslat eller kommer fällningen efter ytterligare spädning med antisolvent. MIVM kan aktivera högre antisolvent innehåll i blandningskammaren adress core material löslighet begränsningar. Det är ofta användbart att generera övermättnaden kurvor från löslighet data som en funktion av lösningsmedel sammansättning att vägleda process design9. Figur 6 visar representativa kurvor för två föreningar. Låg övermättnaden vid blandande kammare villkor förtjänster på olika kompositioner, vanligtvis med hjälp av MIVM. Högre övermättnaden gynnar kärnbildning av huvudkomponenten över partikel tillväxt men ett matchningsfel för monteringstid av materiellt kärna ur och stabilisatorn kan resultera i stora aggregat av den terapeutiska. D’Addio och Prud’homme har granskat tillämpningen av sådana övermättnaden kurvor i detalj9. Slutligen BKP molekylärt måste upplösas i lösningsmedel strömmen och den antisolvent strömmen måste vara selektiv för ett kvarter. BCP-reglerna måste vara tillräckligt amfifila att ge både en solvophobic drivkraft från blocket kollapsade att förankra stabilisatorn på partikeln ytbehandlar och för solvatiserade blocket att förmedla sterisk stabilitet till partikeln. Lösningsmedel än de som beskrivs i protokollet kan användas så länge de uppfyller dessa begränsningar.
Öva med manuell spruta drift kan förbättra framgång under screening. Som nämnts ovan, innebär ovan övergången till homogena, turbulent blandande villkor att små variationer i flödet tolereras i processen28. Skala upp till pump-driven, dator-kontrollerade flöden resulterar i ännu större vinster i konsistensen på grund av reproducerbara inlopp flödesvärden. Vid något tillfälle under efterbearbetning av partiklarna, kan okulärbesiktning eller DLS analys tyda på närvaro av stora aggregat vilket kan bero på tillfällig damm eller partikel instabilitet. Vid behov kan strömmen filtreras med ett lämpligt filter porstorlek. I avsaknad av aggregat, har vi funnit att mindre än 5% massa förloras vanligtvis när filtrering PEG-belagd nanopartiklar om nominella filtret storlek är större än fördelningen av partiklarnas storlek. När filtrering aggregat, Experimentell bestämning av massa förlorade under processen är nödvändigt. Kvantifiering av massa förlusten kan utföras på ett av två sätt. Totala fasta massan i en given volym kan bestämmas genom termogravimetrisk analys före och efter filtrering för att identifiera omfattningen av förändringen (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Alternativt, partiklarna kan vara återvunna (t.ex., genom att frystorka den) och upplöst i ett bra lösningsmedel. Koncentrationen av materiellt kärna ur kan sedan direkt mätas med en lämplig teknik såsom ultraviolett-synligt spektrofotometri eller kromatografi.
För FNP, måste de återstående 10 vol % organiskt lösningsmedlet (t.ex., THF) tas bort från vattendispersion. Detta kan göras genom evaporativ destillation14,29, dialys30eller tangentiell flow filtrering31,32. Praktiska överväganden för varje bearbetningssteg beskrivs i beaktandeleden som tillhandahålls. För dialys är typiska membran 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, även om större alternativ finns. Detta molekylvikt cutoff räcker för lösningsmedel borttagning när dialyseras för 24 h använder flera bad förändringar. Användning av tangentiella flow filtrering medför vissa processutveckling som var noga med att undvika inducerande aggregation på grund av koncentrationen polarisering membran yta. Vi har funnit att minska organiska lösningsmedel sammansättning under ett system-beroende värde, vanligtvis 2-10 vol.%, eliminerar aggregering membran yta. Efter bearbetning, bestäms lätt koncentrationen av nanopartiklar genom termogravimetrisk analys (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Det är ofta önskvärt att transportera eller förvara partiklar i en mycket stabil form. Aqueous dispersioner kan enkelt frysas snabbt använda en torr-is/aceton blandning och sedan förvaras vid-80 ° C. Alternativt, torrt pulver kan erhållas genom att frystorka den33,34 eller spraya torkning24. Ofta måste en frysskyddmedel läggas till minska nanopartiklar aggregation under frysning eller torkning. Socker (sackaros, trehalos, etc.), poly(ethylene glycol) eller cyklodextrin kan undersökas för effektivitet över en serie koncentrationer av kontroll storleken av DLS35,36,37, 38. Vanliga NP stabilitetsproblem under behandling är ofta relaterade till löslighet eller fas separation i kärnan resulterar i rearrangering mot ett lägre energitillstånd under förhållanden där rörlighet ökas. Användning av samtidig kärnan material, alternativa stabilisatorer eller modifierad extern lösning sammansättning kan bidra till att förbättra stabilitet14,16,17,39,40, 41.
Som nämnts ovan, gör MIVM högre antisolvent innehåll i blandningskammaren när krävs för att uppnå hög övermättnaden. Det kan också möjliggöra fysisk åtskillnad av arter i mer än två strömmar när reaktivitet eller löslighet begränsningar kräver det. Ett exempel är bildandet av zein protein-stabiliserad nanopartiklar av den antibiotiska klofazimin24. Den hydrofoba klofazimin introduceras i en aceton ström; Zein introduceras i en 60% enprocentig vattenlösning ström; kasein, som komplex med zein, förs in med en vattenlösning buffert ström, och den fjärde stream är extra buffert att öka förhållandet mellan vatten till aceton och etanol. Två vätska strömmar krävs eftersom klofazimin och zein inte är lösligt i ett vanligt lösningsmedel. Denna process skulle inte kunna åstadkommas inom en två-jet CIJ mixer. Detta protein-stabiliserad formulering visar också att FNP inte är begränsat till BCP stabilisatorer. Janus partiklar har producerats utan stabilisator42 och en rad billiga stabilisatorer har påvisats för muntliga ansökningar24. Särskilt, kan sampolymerer såsom hydroxipropylmetylcellulosa användas i stället för block sampolymerer24. Kärnan material kan göras mer hydrofoba genom ett antal olika tekniker. Hydrofoba ion ihopparning har tillämpats för att kapsla in ett brett utbud av föreningar som har mellanliggande löslighet43,44,45. Extremt hydrofoba prodrugs har varit genereras och sedan inkapslade46. Nukleinsyror har införlivats genom komplexbildning med katjoniska lipider47. Ännu viktigare, har dessa studier visat att FNP kan producera en rad partikel ytan kemiska sammansättningar. Ytterligare, blandad stabilisatorer som innehåller en bråkdel av BCP som har modifierats med en inriktning ligand på kedjan slutet har använts. Detta möjliggör exakt kontroll över ligand innehåll på ytan eftersom partikeln sammansättning speglar indataström sammansättning23,48. Likaså är det möjligt att införliva flera huvudkomponenter samt, inklusive färgämnen och oorganiska nanopartiklar3,8.
Flash NanoPrecipitation är en skalbar metod för polymera nanopartiklar består av antingen en hydrofob och en hydrofil kärna. Om de kriterier som räknas upp ovan är uppfyllda, vanligen kapslas över 95% av materiellt kärna ur på hög massfraktionen i partikeln. De tre exemplen som presenteras här genomfördes på bänk skala, som kräver några milligram av material och cirka 0,5 mL i varje inlopp ström. Detta möjliggör snabb screening av partikel villkor för formulering optimering. Uppskalning av bly formuleringar till större batchstorlekar handlar om kör processen längre, som lätt kan uppnås genom användning av sprutpumpar eller Flödesregleringsventiler. Däremot ansikten att skala upp bulk tillägg nanoprecipitation väldokumenterade utmaningar att upprätthålla tillräcklig micromixing vid tidpunkten för tillägg och redovisning av effekten av att ändra fartygets geometri49. Detta är ett stort hinder, eftersom det är avgörande att tillverka partiklar på ett konsekvent sätt att möta FDA krav50. Mikrofluidik tekniker kan också producera uniform, reproducerbara nanopartiklar, men endast möjliggöra produktion i intervallet milligram. Till exempel rapporterade Karnik et al. produktionstakt 0,25 mg/min för en läkemedelsfrisättning studera51. Ytterligare skala upp innebär vanligtvis parallelization på hög kapitalkostnad12. Med FNP är det enkelt att producera 1 gram av nanopartiklar på 600 mg/min med en sprutpump och några beslag att ansluta till mixer öppningarna. FNP representerar följaktligen en tillgänglig lab-skala screeningmetod för såväl som en skalbar metod för NP produktion för translationell arbete.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av medel från Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (Fortsättningssatsningen 1605816), av Bill och Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) och National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tilldelas K.D.R.
Confined Impinging Jets Mixer | NA | NA | See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation |
Luer fitting | Idex Health & Science | P-604 | Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads |
Plug fitting | Idex Health & Science | P-309 | Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling) |
Outlet fitting – CIJ | Idex Health & Science | P-205 | Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet |
Outlet ferrule – CIJ | Idex Health & Science | P-200 | Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing) |
Outlet tubing – CIJ | Idex Health & Science | 1517 | Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher Scientific | T425-4 | Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications. |
Norm-ject syringe (3 ml) | VWR | 53548-017 | |
Vitamin E (α-tocopherol) | Sigma-Aldrich | 90669-50G-F | Store cold |
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k | Polymer Source | P13141-SEO | Other block sizes acceptable depending on application |
poly(styrene)1.8k | Polymer Source | P2275-S | Example hydrophobic core material |
Scintillation vial | DWK Lifesciences | 74504-20 | |
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) | National | S7510-1 | |
Maltodextrin DE 4-7 | Sigma-Aldrich | 419672-100G | |
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k | Polymer Source | P5917-SAA | Other block sizes acceptable depending on application |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D159-4 | |
Calcium chloride dihdyrate | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Hygroscopic. |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) | Sigma-Aldrich | A5503-1G | |
Multi-Inlet Vortex Mixer | NA | NA | See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation |
Outlet fitting – MIVM | Idex Health & Science | P-942 | Combination with ferrule |
Outlet tubing – MIVM | NA | NA | Fit to ferrule ID. |
O-ring (MIVM) | C.E. Conover | MM1.5 35.50 V75 | Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source. |
Mixer stand | NA | NA | See Markwalter & Prud'homme for design.17 |