Effektiv genom engineering af Candida albicans er afgørende for forståelsen af patogenesen og udvikling af lægemidler. Her, beskrev vi en protokol for at hurtigt og præcist redigere C. albicans genom ved hjælp af CRISPR. Protokollen giver mulighed for efterforskerne at indføre en lang række genetiske modifikationer herunder punktmutationer, indsætninger og sletninger.
Denne metode beskriver den effektive CRISPR medieret genom-redigering af den diploide menneskelige svampe patogen Candida albicans. CRISPR-medieret genom-redigering i C. albicans kræver Cas9, guide RNA, og reparere skabelon. Et plasmid, udtryk for en gær codon optimeret Cas9 (CaCas9) er blevet genereret. Guide sekvenser direkte opstrøms fra en PAM websted (NGG) er klonet i Cas9 udtryk vektor. Reparation skabelon er derefter foretaget af primer udvidelse i vitro. Cotransformation reparation skabelon og vektor i C. albicans fører til genom-redigering. Afhængigt af den reparation skabelon anvendes, kan investigator indføre nukleotid ændringer, indrykninger eller sletninger. Som C. albicans er en diploid, lavet mutationer i begge alleler for et gen, forudsat at A og B alleler ikke havnen SNPs, der forstyrrer guide målretning eller reparere skabelon indarbejdelse. Stor gene familier kan redigeres parallelt, hvis egnet bevarede sekvenser findes i alle familiens medlemmer. C. albicans CRISPR systemet beskrevet er flankeret af FRT websteder og koder flippase. Ved induktion af flippase, er antibiotika markør (CaCas9) og guide RNA fjernet fra genomet. Dette tillader investigator skal udføre efterfølgende redigeringer af genomet. C. albicans CRISPR er en kraftfuld svampe genteknologi værktøj, og mindre ændringer i de beskrevne protokoller tillader ændring af andre svampe arter, herunder C. glabrata, N. castellii, og S. cerevisiae.
Candida albicans er den mest udbredte menneskelige svampe patogen1,2,3. Forståelse forskelle mellem C. albicans og pattedyr Molekylærbiologi er afgørende for udviklingen af den næste generation af svampedræbende therapeutics. Dette kræver efterforskerne at være i stand til hurtigt og præcist genetisk manipulere C. albicans.
Genmanipulation af C. albicans har historisk set været udfordrende. C. albicans opretholde ikke plasmider, således alle konstruktioner skal inkorporeres i genomet. Derudover er C. albicans diploide; Derfor, når udskære et gen eller at indføre en mutation, det er vigtigt at sikre, at begge kopier har været ændret4. Derudover er nogle C. albicans loci heterozygous, yderligere komplicerer genetiske forhør5. For at genmanipulere C. albicans, er det typisk til at udføre flere runder af homologe rekombination6. Men diploide art genom og besværlige konstruere udvikling har gjort dette en potentielt kedelig proces, især hvis der kræves flere ændringer. Disse begrænsninger og medicinsk betydningen af C. albicans kræver udvikling af nye teknologier, der giver efterforskerne til lettere manipulere C. albicans genom.
Grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-medieret genom-redigering er et kraftfuldt værktøj, der giver forskere til at ændre rækkefølgen af en genom. CRISPR kræver tre komponenter: 1) den Cas9 nukleasen, der kløver target-DNA, 2) en 20 basere guide-RNA, som er rettet mod Cas9 til sekvensen af interesse, og 3) reparation skabelon DNA, der reparerer webstedet kavalergang og inkorporerer tilsigtet ændring7, 8. Når guiden bringer Cas9 til target genomet sekvens, Cas9 kræver en protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens (NGG) direkte opstrøms af guide sekvens til kløver DNA9. Kravet om, at både den 20 base guide og PAM sekvenser giver en høj grad af målretning specificitet og begrænser off target kavalergang.
CRISPR systemer er designet til at redigere genomer af et mangfoldigt sæt af organismer og tackle en bred vifte af problemer10. Beskrevet her er en fleksibel, effektiv CRISPR protokol for at redigere et C. albicans gen af interesse. Eksperimentet introducerer en stop codon et gen, forårsager oversættelse opsigelse. Andre redigeringer kan gøres afhængig af skabelonen reparation, der er indført. En fragment mærket med nourseothricin (Natr) indeholdende gær codon-optimeret Cas9 (CaCas9) og en guide RNA er indarbejdet i C. albicans genom på et neutralt sted. Cotransformation med reparation skabelon kodning ønskede mutationen fører til reparation af kløvningen af homologe rekombination og effektiv genom-redigering. Beskrevet nedenfor er redigering af TPK2, men alle C. albicans åben læsning rammer kan målrettes flere gange af CRISPR. CRISPR systemet er flankeret af FRT websteder og kan fjernes fra C. albicans genom ved induktion af flippase kodet på CaCas9 udtryk plasmid. C. albicans CRISPR systemet muliggør efterforskere hurtigt og præcist redigere C. albicans genom11,12.
C. albicans CRISPR effektivt redigeringer C. albicans genom. pV1524 koder en gær codon-optimeret Cas9 og er designet således, at efterforskere kan nemt klone guide RNA sekvenser nedstrøms CaSNR52 promoter (figur 1)11. Det skal sikres, at kun en enkelt kopi af guide sekvens har været klonet i CaCas9 udtryk vektorer af sekventering, som ekstra eksemplarer vil hindre genom-redigering. Hvis flere kopier af guiden er indført konsekvent, bør en lavere koncentration af udglødet guide bruges i ligatur. Vektor og beskrevet-protokollen giver mulighed for målretning af enhver C. albicans gen. Selv om C. albicans er diploide, er kun en enkelt transformation forpligtet til at målrette begge alleler for et gen. Desuden giver processive art CRISPR-CaCas9 genom-redigering forskerne til at målrette flere medlemmer af genet familier. Mange gen familier som udskilles aspartyl proteaser (SAPS) og agglutinin-lignende sekvens proteiner (ALS) er vigtige for C. albicans virulens. CRISPR genom-redigering vil lette undersøgelsen af disse gen familier.
De protokoller, der er beskrevet ovenfor introducere en stop codon til en åben læsning ramme, hvilket resulterer i fænotypisk svarer til en null-værdi (figur 2). En lang række genetiske vekslen kan gøres ved at variere reparation skabelonen. Vrøvl, missense og tavse mutationer kan indsættes via rekombination med en passende reparation skabelon. Inkorporering af en restriktion stedet strømliner transformant screening, som dem uden skal screenes af sekventering12,13. C. albicans CRISPR kan desuden forskere til at generere indsættelser og sletninger, hvilket gør det et ideelt system til at indsætte affinitet tags, udføre promotor swaps og generere knockouts (figur 3). Screening for korrekte transformants for disse mutationer er mere besværlig, da det er nødvendigt at sekvens redigeringer for at bekræfte korrekte indarbejdelse af reparation skabeloner. Derudover kan sydlige skamplet blive nødvendigt at sikre yderligere kopier af et gen ikke er indsat flere steder i genomet. Kravet om webstedet NGG PAM steder mindre begrænsninger på områder af genomet, der kan målrettes. Udvikling af alternative CRISPR systemer, der anvender alternative nukleaser såsom Cpf1 eller variationer over Cas9 system har/vil afhjælpe mange af disse begrænsninger14. Efterforskere viden på dette tidspunkt, har disse systemer ikke endnu blevet anbragt til C. albicans.
CRISPR systemet beskrevet i ovennævnte protokol er udviklet sådan, at det kan anvendes i en bred vifte af arter, herunder Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliiog den menneskelige patogen Candida glabrata11 . Transformation og effektiv redigering af disse gær kræver mindre ændringer til den beskrevne protokol, men rammerne for redigering disse alternative genomer er bemærkelsesværdigt ens til som beskrevet for C. albicans12. Desuden gær giver en udmærket mekanisme til at udvikle genom-redigering procedurer. I gær, når ADE2 er muteret, akkumuleres en forløber for adenin biosyntese pathway, vender cellerne røde. Denne nemt observerbare fænotype giver efterforskerne at identificere redigerede celler og hurtigt fejlfinding genom-redigering protokoller. Kombineret med omfattende Molekylærbiologi værktøjskassen tilgængelig for svampe, har protokoller til redigering mange gær arter været udviklede15,16. Sådan en bred anvendelse af genom-redigering teknologi i svampe har potentiale til at betydeligt påvirke en lang række videnskabelige discipliner.
CRISPR har væsentligt forbedret effektiviteten af genom engineering i C. albicans, men indtil CRISPR er ikke blevet brugt til at udføre genom brede skærme i C. albicans. Nuværende protokoller kræver en reparation skabelon at indføre mutationer, som den nonhomologous ende tiltræder pathway i C. albicans er ineffektive12. Generation af reparation skabelon oligos for hvert gen er en betydelig hindring for udførelsen af genome-wide skærme. Sammenløbet af nedsat omkostningerne ved DNA-syntese og forskud til CRISPR teknologier vil gøre udviklingen af sletning biblioteker mere gennemførlig. For eksempel, baner udtryk for en reparation skabelon fra CaCas9 vektor vejen for udvikling af bæredygtig plasmid biblioteker, der er målrettet alle gen11. Derudover har forbigående Candida CRISPR protokoller, der ikke kræver CaCas9 udtryk vektor indarbejde i C. albicans genom været udviklede17. Derudover steg guide udtryk stigninger genom-redigering effektivitet18. Disse og andre fremskridt til CRISPR teknologier, er afgørende for udviklingen af genome-wide skærme i C. albicans19,20,21,22.
C. albicans genom er diploid, men A og B alleler er ikke altid identiske5. Sådanne heterozogycitet giver både udfordringer og muligheder. Hvis man har til formål at målrette begge alleler, skal en PAM site, guide sekvens og reparation skabelon, der skal fungere på begge kopier af genet anvendes. Dog giver afhængig af enkelt nucleotid polymorfier i et gen, C.albicans CRISPR system efterforskerne til at målrette en enkelt allel. Sådan præcision har potentiale til at tillade efterforskere at undersøge funktionelle forskelle mellem alleler. Rettet mod specifikke alleler skal gøres forsigtigt, som tab af heterozygositet (LOH) på en allel eller af en hel kromosom er blevet observeret. Når du redigerer enkelt C. albicans alleler, man skal undersøge tilstødende DNA-sekvenser for at bestemme, hvis en klon har opretholdt en diploide SNP profil. Derudover off target effekter er ganske lav for C. albicans CRISPR, men hele genome sequencing kan anses for vigtige stammer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dr. Gennifer Mager for læsning og nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Ball State University laboratorium start midler og NIH-1R15AI130950-01-D.A.B.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |