셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여
Summary
우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.
Abstract
세균성 병원 체 생존 하 고 한 번 진 핵 세포 안에 증식 고용 전략의 다양 한이 있다. 소위 ‘cytosolic’ 병원 균 (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, 그리고 리케차 종)에 의해 감염 된 세포 cytosol에 액세스 육체적으로 그리고 효소 저하 기본 vacuolar 막. 일단, cytosol에서이 균 모두 증식 뿐 아니라 새로운 세포를 감염 하기 위하여 주인 세포의 원형질 막에 침투 하는 충분 한 기계적인 힘을 생성. 여기, 우리 보여 어떻게 L. monocytogenes (Lm)의 세포 감염 주기의이 터미널 단계 식민지 형성 단위 분석 및 cytometry 양이 정해질 수 있다이 어떻게 모두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요인 영향의 예를 들 프로세스입니다. 우리 또한 보여 쥐에서 파생 된 간 세포의 감염 및 배양된 세포의 Lm 감염 역학의 가까운 통신 감염 생체 외에서 vivo에서. 이러한 함수 기반 분석 실험은 상대적으로 간단 하 고 변조기의 진 핵 세포의 기능에 대 한 높은 처리 화면 검색 기반 쉽게 확장 될 수 있습니다.
Introduction
감염-기반 실험 모델은 호스트와 병원 체, 다양 한 병원 체 감염 전략, 그리고 병원 체 및 호스트-기반 프로세스를 할당의 어려움의 시작 상태 조건에 그들의 의존 때문에 본질적으로 도전 결과 기반으로 합니다. Listeria monocytogenes (Lm) 박테리아의 유전과 미생물의 추적성, 그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 전략 및 상대적으로 분명 호스트 방어 응답을 이상적인 병원 체 되고있다 그것의 휴대 organismic-수준 감염 고기 사이의 관계. Lm 의 세포 감염 4 가지 단계1를 통해 진행: (i) 세포 침공 Lm 공포; 포함 되 고로 종결 (ii) Lm-공포 막의 해체 그리고 cytosol;에 Lm 의 릴리스 감독 (iii) intracytosolic 복제; 그리고 (iv)는 플라즈마 막 직접 인접 한 세포 (상피 시트 등)의 감염 또는, 독방 세포, extracellular 환경으로 Lm 의 출시의 물리적 침투. 이러한 단계의 각 특정 Lm에 의해 추진 됩니다-인코딩된 요소 (‘독성 요인’ 라고도 함), 삭제, 감염 결함 세포 및 동물 모델에서 발생할. 이 일반적인 감염 전략은 독립적으로 진화 되었습니다 아니라 소위 ‘cytosolic’ 병원 체2의 숫자에 의해.
콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 둘 다 생체 외에서 평가를 널리 고용 됩니다 (즉, 셀룰러) 뿐으로 vivo에서 (즉, organismic) 감염 결과. Vivo에서 감염에 대 한 특히 그들의 높은 감도 뿐만 아니라 분석 실험 CFU 병원 체 침입 및 세포내 생존/확산에 대 한 명확한 판독을 제공합니다. CFU 분석 광범위 하 게 영향을 미치는 감염 Lm 및 호스트 셀 결정 요인 분석에 사용 되었습니다. 이러한 사전 연구 분석 세포 침입과 intracytosolic 복제 하 왔다 유익한, CFU 분석 사용 되지 않은, 우리의 지식의 최선을 Lm 감염 과정의 4 단계를 추적 하: 셀룰러 탈출. 여기, 우리는 상대적으로 간단한 CFU 분석 결과 (물론 cytometry) (‘출현’ 라 함)는 어떻게 세포 탈출 수단을 모니터링할 수 있습니다 및 어떻게 두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요소의 표시 예 규제 Lm의이 단계 설명 감염 주기. 세포질 Lm 감염 사이클의 터미널 단계 분석 추가 병원 체 및 호스트 세포 감염 관련 요인 및 활동 파악 가능 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 프로그램 Lm 은 감염에 영향을 주는 세포 활동을 조사 하는 이상적인 병원 체. 호스트 요인의 수는 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 Lm 세포 감염11,12,,1314확인 되었습니다. 두 같은 Perforin 2와 헤 규제 억제제 우리의 실험실에서 특징 요소 호스…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
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