En klumpformet drab Assay af bil T celler

Summary

Denne protokol er designet til at vurdere immunterapeutisk omdirigerede T-celle (bil T-celle) cytotoksicitet mod 3D struktureret kræft celler (spheroids) i realtid.

Abstract

Immunterapi er blevet et område af voksende interesse i kampen mod kræft ellers uhelbredelige. Blandt alle immunterapeutisk metoder omdirigeret kimære antigen receptor (bil) T celler opnået de mest spektakulære resultater, navnlig med pediatric B-akut lymfoblastær leukæmi (B-ALL). Klassisk validering metoder af bil T celler er afhængige af brugen af specificitet og funktionalitet assays bil T celler mod målet celler i suspension og xenograft modeller. Desværre, bemærkninger, in vitro-er ofte afkoblet fra resultaterne i vivo og en masse indsats og dyr kunne være sparet ved at tilføje en anden skridt: brugen af 3D kultur. Produktionen af spheroids ud af potentielle target-cellerne, der efterligner 3D-struktur af tumorcellerne, når de er i aflægger i en dyremodel repræsenterer et ideelt alternativ. Her rapporterer vi en overkommelig, pålidelig og nem metode til at producere spheroids fra en transduced kolorektal cellelinie som en efterprøvelse værktøj for adoptivforældre celleterapi (eksemplificeret her af CD19 bil T-celler). Denne metode er kombineret med et avanceret live imaging system, der kan følge klumpformet vækst, effektor celler cytotoksicitet og tumor celle apoptose.

Introduction

Adoptivforældre celle overførsel (ACT) repræsenterer den næste generation kræftbehandling. Det er baseret på indsprøjtning af effektor celler (T – eller NK-celler) i en patient. Disse celler kan være genetisk modificerede med en receptor, der vil guide dem til deres mål, tumor, og ødelægge den. For nylig blev denne tilgang vist sig at være muligt, når en kimære Antigen Receptor (bil) rettet mod B-celle markør CD19 blev indført i patienten T celler til at dræbe sin kræft¹. I tilfælde af CAR, som er en kunstig receptor, design består af specifikt antistof fragmenter, antigenet bindende domæne reduceret til en enhed udpegede enkelt kæde variable fragment (scFv), forbundet med T-celle signalering domæner. Selv om der er flere designs, de mest almindeligt anvendte versioner omhandlet som andengenerations bildesign, består af CD3z for TCR signalering og et co-stimulatory domæne (CD28, 4-1BB, OX40, osv.) ^{1 , 2}. feltet immunterapi rettet de fleste af sin opmærksomhed mod denne nye form for handling, når CD19 bil-T celler efficaciously behandlet mange patienter med B-celle maligniteter^3,4. Efter denne succes, forskere forsøgt at udnytte de lignende design ved at målrette andre epitoper for solide tumorer med begrænset succes. Desværre, knaphed på tumor gruppespecifikke antigener og de barskere tumor microenvironments gengives bil T celler mindre effektiv mod solide tumorer⁵.

I øjeblikket, stole de mest almindeligt anvendte i vitro validering strategier på todimensionelle (2D) systemer, der kun vedrører et fragment af de allerede nævnt solid tumor udfordringer. Klassisk, omfatter 2D in vitro- systemer en blanding af bil T-celler og target kræft cellelinjer som encellelag vurdering af funktionalitet og specificiteten af disse effektor celler. Selv om disse strategier er vigtige og vitale dele af undersøgelserne, tager de ikke hensyn til komplekse morfologi og tredimensionale (3D) struktur af kræft celler⁶. Kræftceller dyrkes i 3D systemer, omtales som spheroids, erhverve nye fænotypisk træk gennem ændringer i gen expression profil⁷, som kan påvirke anerkendelse af omdirigerede effektor celler. Birgersdotter og kolleger viste, at en Hodgkin lymfom (HL) cellelinie når kun dyrkes i en 3D kultur model erhverver en gen expression profil, der svarer til primær tumor prøver⁸. Derfor, spheroids eller lignende 3D kultur metoder tilbud mere relevant i vitro modeller i stedet for standard 2D systemer. Sådanne systemer er også svarer til in vivo-undersøgelser, som ses som det sidste trin i valideringsprocessen for en given bil. I betragtning af at 2D systemer ikke efterligne morfologi af kræft klynger, spheroids tilbyder lignende formationer for at vurdere funktionaliteten af bil T celler forud for in vivo modeller. I en undersøgelse, Pickl et al. konstateret, at en klumpformet model af human epidermal vækstfaktor receptor (HER2) overekspression kræftceller viste lignende signaling profiler til in vivo modeller⁹. Dette understøtter yderligere, at spheroids tilbyder mere relevante og afslutning-til-in vivo vurdering af bil T-celler. Derudover bil T-celle validering mod spheroids kan hjælpe med at vurdere deres effektivitet, mere kritisk og forhindre, at nogle af designene flytter til in vivo-undersøgelser for tidligt¹⁰; således bidrager til etisk berørte forskning ved at ofre færre dyr. Derudover er protokoller ved hjælp af spheroids ikke dyrere end klassisk 2D systemer og meget hurtigere i forhold til klassisk i vivo undersøgelser. Taget sammen, kan man forudsige, at medtagelsen af klumpformet undersøgelser snart vil blive standardpraksis at sammenkæde in vitro- og in vivo undersøgelser.

Vi præsenterer her, forberedelse af spheroids fra colon cancer cellelinie HCT 116. Denne cellelinje blev ændret for at udtrykke den menneskelige CD19 molekyle at gengive det følsomme over for CD19 bil T-celler og give en klar vurdering af aflivning ved hjælp af en klinisk validerede bil konstruktion.

Protocol

1. generation af Spheroids fra kolorektal Cancer cellelinie Vaske HCT 116 (stabilt transduced for at udtrykke klynge af differentiering 19 (CD19) og grøn fluorescens Protein (NGL)) celle encellelag med phosphat bufferet saltvand (PBS, 5 mL til en 25 cm2 eller 10 mL til en 75 cm2 kolbe). Tilføje trypsin (0,5 mL til en 25 cm2 eller 1 mL til en 75 cm2 kolbe) og inkuberes celler ved 37 ° C i 5 min. Kontrollere celle detachement under et mikroskop og neutralis…

Representative Results

Som det kan ses i figur 1, er det afgørende at kontrollere ved flowcytometri udtryk af CD19 bil på T-celler (figur 1A) og niveauet af CD19 på HCT116 tumor cellelinjer (figur 1B). Figur 2 illustrerer resultatet af en typisk klumpformet eksperiment. Automatiseret billedbehandling apparatet tager billeder i fire forskellige kanaler: lysfelt, fase, grøn og rød fluoresce…

Discussion

Brugen af spheroids som et innovativt værktøj til at validere fremtidige kræftbehandling er blevet et område af voksende interesse i de seneste år. Spheroids repræsenterer en mellemting mellem klassisk 2D analyse af in vitro- og in vivo vurdering. Metoden yderligere holder en masse løfte om deres styrke i form af tumor mikro-miljø efterligne samt gen profilering⁷. Den protokol, der præsenteres i denne publikation blev tilpasset fra Saheen et al.¹¹ til Incu…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience