פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך immunotherapeutic cytotoxicity T-cell (המכונית T-cell) שנותבו מחדש נגד 3D מובנות תאים סרטניים (spheroids) בזמן אמת.
חיסוני הפך שדה של עניין הולך וגובר במאבק נגד סרטן חשוכת אחרת. בין כל שיטות immunotherapeutic, chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) מנותב מחדש תאי T שהושגו התוצאות המרהיבים ביותר, במיוחד עם ילדים לוקמיה לימפובלסטית חריפה-B (B-כל). שיטות אימות הקלאסית של תאי T המכונית לסמוך על השימוש היחודיות מבחני פונקציונליות של תאי T מכונית נגד התאים היעד ההשעיה, במודלים xenograft. למרבה הצער, תצפיותיו במבחנה הם לעתים קרובות decoupled מן התוצאות המתקבלות vivo, הרבה מאמץ וחיות יכולה להינצל על ידי הוספת עוד צעד: השימוש של תרבות תלת-ממד. הייצור של spheroids מחוץ לתאים יעד פוטנציאליים המחקים את מבנה תלת-ממדי של תאי הגידול כאשר הם נמצאים engrafted לתוך המודל בעלי חיים מייצג חלופה אידיאלית. כאן, אנחנו מדווחים שיטה קלה ובמחיר כדי לייצר spheroids משושלת transduced תא המעי הגס ככלי אימות עבור טיפול בתא המאמצת (כאן לידי ביטוי CD19 המכונית T תאים). שיטה זו זה משולב עם מערכת הדמיה חיה מתקדמת, ניתן לקיים צמיחה ספרואיד, אפקטור תאים אפופטוזיס תא cytotoxicity, הגידול.
העברה לתא המאמצת (ACT) מייצג את הטיפול בסרטן הדור הבא. זה מסתמך על ההזרקה של תאים אפקטור (T – או NK-תאים) לתוך החולה. תאים אלה יכול להיות שונה גנטית עם קולטן זה להנחות אותם למטרה שלהם, הגידול, ולהרוס אותו. לאחרונה הוצגה גישה זו להיות ריאלי כאשר Chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) נגד דה מרקר B-cell CD19 הוצג לתוך התאים החולה T להרוג סרטן /1. במקרה של המכונית, אשר קולטן מלאכותי, העיצוב מורכב מקטעי נוגדנים ספציפיים, אנטיגן מחייב תחום מופחתת למקטע ישות שרשרת יחידה ייעודית משתנה (scFv), מקושרים לתחומים איתות T-cell. למרות שיש מספר עיצובים, הגירסאות הנפוצות ביותר המכונה כמו הדור השני רכב עיצובים, מורכב CD3z עבור מערכת אזעקה TCR ובתחום co-stimulatory אחד (CD28, 4-1BB, OX40, וכו.) 1 , 2. השדה חיסוני מכוונת רוב תשומת הלב שלה צורה חדשה של מעשה כאשר CD19 רכב-T תאים efficaciously באין ספור מטופלים עם תא B-מחלות ממאירות-3,–4. בעקבות הצלחה זו, החוקרים ניסו לנצל את העיצובים דומה על ידי מיקוד אחרים epitopes עבור גידולים מוצקים עם הצלחה מוגבלת. למרבה הצער, המחסור גידול אנטיגנים ספציפיים, את microenvironments גידול קשים שניתנו המכונית T תאים פחות יעיל לקראת גידולים מוצקים5.
כיום, האסטרטגיות אימות הנפוצים בשימוש במבחנה להסתמך על מימדי מערכות (2D) המטפלות רק קטע מן האתגרים כאמור לעיל גידולים מוצקים. באופן קלאסי, 2D במבחנה מערכות לערב תערובת של תאי T רכב המטרה שורות תאים סרטן כמו monolayers כדי להעריך את הפונקציונליות וספציפיות של תאים אלה אפקטור. אסטרטגיות אלו הן חלקים חשוב וחיוני של המחקרים, אך הם אינם מביאים בחשבון את המבנה התלת-ממדי (3D) של תאי סרטן6ומורפולוגיה מורכבים. תאים סרטניים תרבותי במערכות תלת-ממד, המכונה spheroids, רוכשים חדשים פנוטיפי היסודיות לשינויים ג’ין ביטוי פרופיל7, אשר עשויים להשפיע על ההכרה על ידי תאים אפקטור שנותבו מחדש. Birgersdotter ועמיתיו הראו כי הודג’קין לימפומה (HL) קו תא כאשר גדל רק בדגם תלת-ממד תרבות רוכשת את פרופיל ביטוי גנטי דומה לזו דגימות הגידול העיקרי8. לכן, spheroids או 3D דומה תרבות מתודולוגיות הצעה יותר הרלוונטיים במודלים חוץ גופית לעומת תקן מערכות דו-ממדיות. מערכות אלו דומים גם מחקרים ויוו אשר נתפסים השלב הסופי בתהליך האימות של מכונית נתונה. בהתחשב בכך כי מערכות דו-ממדיות להיכשל לחקות את המורפולוגיה של סרטן אשכולות, spheroids מציעים תצורות דומות כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי T רכב לפני ויוו מודלים. במחקר אחד, Pickl et al. זיהה כי מודל ספרואיד של קולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (HER2) overexpressing תאים סרטניים המחישו דומה פרופילים איתות מודלים ויוו9. זה תומך בהמשך כי spheroids מציעים יותר רלוונטי ולא מקרוב פנימה vivo הערכה של תאי T המכונית. בנוסף, המכונית T-cell אימות נגד spheroids עשוי לעזור להעריך את יעילותם יותר ביקורתי ולמנוע חלק מהעיצובים העברת מחקרים ויוו בטרם עת10; לפיכך, תורמים מחקר מודאג מבחינה מוסרית ע י הקרבת בעלי חיים פחות. יתר על כן, פרוטוקולים באמצעות spheroids אינם יקרים יותר מאשר מערכות דו-ממדיות קלאסית, הרבה יותר מהר לעומת לימודים קלאסיים ויוו . יחדיו, ניתן לחזות כי הכללת לימודי ספרואיד תהפוך בקרוב יאושם לקשר מחקרים במבחנה ויוו.
כאן, אנו מציגים את הכנת spheroids מתוך שורת תאים סרטן המעי הגס של HCT 116. הקו תא שונתה כדי להביע את המולקולה CD19 אנושי כדי להפוך אותה רגישות תאי T המכונית CD19 וכדי לספק הערכה ברורה של ההרג באמצעות מבנה המכונית קלינית המאומת.
השימוש spheroids ככלי חדשניים כדי לאמת את הטיפול בסרטן בעתיד הפך שדה של עניין הולך וגובר בשנים האחרונות. Spheroids מייצגים שלב ביניים בין קלאסי 2D ניתוח במבחנה בהערכת vivo. השיטה עוד מחזיקה הרבה הבטחה לגבי מחוזקה במובן של הגידול סביבת מיקרו מחקה כמו גם גנים פרופילים7. פרוטוקול מוצג בפרסום…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר נורבגי תחת מענקים #244388, #254817, #284983; האגודה למלחמה בסרטן נורווגי (#6829007); נורווגית-בריאות באזור דרום-מזרח תחת גרנט #17/00264-6 ו- #2016006.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |