자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Summary

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

Abstract

Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.

Introduction

입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암¹환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) ^{1 , 2}. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양^3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그것의 주의의 대부분을 감독. 이 성공 연구원은 제한 된 성공 단단한 종양에 대 한 다른 epitopes를 대상으로 비슷한 디자인을 악용 하려고 합니다. 불행 하 게도, 종양 관련 항 원 및 자동차 T 렌더링 엄격한 종양 microenvironments의 부족 단단한 종양⁵쪽으로 더 적은 효과적인 세포.

현재, 가장 일반적으로 사용 된 생체 외에서 유효성 검사 전략만 이미 언급 한 고체 종양도 전에 조각 하는 2 차원 (2D) 시스템에 의존 합니다. 고전적인, 2D 생체 외에서 시스템 기능 및 이러한 효과 기 세포의 특이성을 평가 하기 위해 monolayers로 차 T 세포와 대상 암 세포 라인의 혼합물을 포함 한다. 이러한 전략은 연구의 중요 하 고 중요 한 부분, 하지만 그들은 복용 하지 마십시오 고려 사항으로 복잡 한 형태와 암 세포⁶의 3 차원 (3D) 구조. 3D 시스템, spheroids로 배양 암 세포 유전자 식 프로필⁷, 리디렉션된 effector 세포에 의해 인식에 영향을 줄 수 있는 변화를 통해 새로운 phenotypic 특성을 획득 합니다. Birgersdotter와 동료 Hodgkin 림프 종 (HL) 셀 라인 3D 문화 모델에만 성장 하는 때 유전자 식 프로필 기본 종양 샘플⁸유사한 취득 하는 것을 설명 했다. 따라서, spheroids 또는 유사한 3D 방법론 제공 표준 2D 시스템 반대로 체 외 모델에 더 많은 관련 문화. 이러한 체계는 또한 유사한 vivo에서 연구는 특정된 자동차의 유효성 검사 과정에서 마지막 단계로 볼 수 있습니다. 2D 시스템 암 클러스터의 형태를 모방 하지 고려 spheroids 제공 하기 전에 차 T 세포의 기능을 평가 하기 위해 비슷한 형성 vivo에서 모델. 한 연구, Pickl 외. 인간 표 피 성장 인자 수용 체 (HER2) 암 세포 overexpressing의 회전 타원 체 모델 vivo에서 모델⁹유사한 신호 프로필 증명 확인. 이 더 더 적절 하 고 주변에-에서 비보의 평가 차 T 세포를 제공 하는 spheroids을 지원 합니다. 또한, 자동차 T-셀 유효성 검사 spheroids에 대 한 그들의 효능을 좀 더 비판적으로 평가 하 고 vivo에서 연구 중간 이동에서 일부 디자인을 방지 도움이 될 수도¹⁰; 따라서, 적은 동물을 희생 하 여 윤리적으로 관련된 연구에 기여. 또한, spheroids를 사용 하 여 프로토콜 되지 않는 더 비싼 클래식 2D 시스템 보다 훨씬 더 빨리 클래식 vivo에서 학문에 비해. 함께 촬영 한 회전 타원 체 연구의 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 연결 하는 표준 연습을 곧 될 것입니다 예측할 수 있습니다.

여기, 우리는 결 장 암 세포 선 HCT 116에서에서 spheroids의 준비를 제시. 이 셀 라인 CD19 자동차 T 세포에 민감한 렌더링 임상 검증된 차 구문을 사용 하 여 살인의 명확한 평가 제공 하 고 인간의 CD19 분자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다.

Protocol

1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성 씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm2 또는 75 c m2 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어. 현미경으로 세포 분리를 확인 하 ?…

Representative Results

그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝?…

Discussion

미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링⁷뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응<em…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience