Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.
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Artigo de método
Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microglial são residentes inatas imunes células do cérebro que constantemente digitalizar seu ambiente com seus longos processos e, após o rompimento da homeostase, passam por rápidas mudanças morfológicas. Por exemplo, uma lesão do laser induz em poucos minutos um crescimento orientado de processos microglial, também chamado de "motilidade direcional", para o local da lesão. Um efeito similar pode ser obtido através da entrega localmente ATP ou serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]). Neste artigo, descrevemos um protocolo para induzir um crescimento direcional de processos microglial em direção a uma aplicação local de ATP ou 5-HT em fatias aguda do cérebro de ratos jovens e adultos e a imagem esta atração ao longo do tempo por microscopia do multiphoton. Propõe-se um método simples de quantificação com software de análise de imagem livre e open-source. Um desafio que ainda caracteriza fatias cerebral aguda é o tempo limitado, diminuindo com a idade, durante o qual as células permanecem em um estado fisiológico. Este protocolo, portanto, destaques algumas melhorias técnicas (secção interface ar-líquido médio, imagem de câmara com uma dupla perfusão) visam otimizar a viabilidade de células microglial durante várias horas, especialmente em fatias de ratos adultos.
Introdução
Microglial células são macrófagos residentes do cérebro e desempenham um papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas1,2. Eles têm uma morfologia altamente ramificada e são constantemente ampliar e retraindo seus processos3,4. Esse comportamento de "digitalização" é acreditado para ser relacionadas e necessárias para o levantamento de seus arredors. A plasticidade morfológica da micróglia é expressa em três modos. Primeiro, alguns compostos rapidamente modulam microglial morfologia: a adição de ATP5,
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Protocolo
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ético local (Comité de Darwin, acordos 1170 # e #10921).
1. preparação de Micropipetas de vidro para a aplicação Local de compostos
- Prepare-se pipetas de borosilicato capilares de vidro de parede fina com um extrator de eletrodo. Ajuste os parâmetros para obter pipetas com um 4-5 µm de diâmetro em sua extremidade. Figura 2D mostra uma pipeta em brightfield baixa ampliação.
2. soluções
- Assegurar que produtos vidreiros único que foi limpa por um ciclo de autoclave, seguido de enxaguamento 2x - 3x com água ul....
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Resultados
Este protocolo descreve um método para induzir, observar e quantificar o crescimento orientado de processos microglial em direção a um composto aplicado localmente, por exemplo, fatias de ATP ou 5-HT, no cérebro agudo de jovem ou adulto (pelo menos até dois meses de idade) ratos. Entre os fatores que contribuem para a manutenção de fatias de cérebro de animais adultos, em um estado saudável durante várias horas, é o uso de duas ferramentas projetado para otimizar a sobrevivência da pilha .......
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Discussão
Mantendo-se, ao contrário de em dissociada ou organotypic fatia de cultura, uma integridade estrutural com ajustes de rede limitada, fatias de cérebro aguda permitem aos pesquisadores estudar microglia no seu ambiente fisiológico. No entanto, uma das principais limitações é o fato de que o procedimento de corte cria lesões que rapidamente podem comprometer a viabilidade de neurônios, particularmente no cérebro adulto. Como microglia são particularmente reactivo ao dano celular, é importante limitar a morte celular neuron.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a célula e tecido Imaging facilidade do Institut du Fer à Moulin, onde foram realizados todos os aquisição de imagem e análise. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Ciências da Université de Sorbonne e por concessões da Sorbonne universidades-Pierre et Marie Curie University ( Programa Emergence-UPMC 2011/2014), da Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, a Fondation de France, a Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", o Ministério francês da pesquisa (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 e o d'Av....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| para preparação de pipetas | |||
| Clark Borosilicato Capilares de Parede Fina | Harvard Aparelho | 30-0065 | Borosilicato Parede Fina sem Filamento, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L, Pkg. de 225 |
| DMZ Extrator Universal | Zeitz Instrumente | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| para soluções | |||
| Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Cloreto de colina | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-glicose | Sigma | G8270 | |
| Solução de cloreto | Sigma | A5960 | |
| 1 M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Cloreto de potássio SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma | S5011 | |
| Piruvato de sódio | Sigma | P2256 | |
| Água ultrapura | MilliQ | para todas as soluções | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| for preparação de fatias | |||
| 2x 200 mL placas | |||
| 80 mL Pyrex béquer | |||
| Antlia-3C Bomba peristáltica digital DD | Biolab | 178961 | Para perfusão de camundongos e perfusão em câmara de 2 fótons (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Papéis de filtro (Whatman) | Papel | de | filtro qualitativo Sigma WHA1001042 Whatman, Grau 1 (Tamanho do poro: 11µ M) |
| Tesouras Finas - Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Caixa de alimentos 10 cm de diâmetro, 8 cm de altura | |||
| cola (etil cianoacrilato) | Loctite | super cola 3 power flex | |
| Ferramenta de Hipócampo (espátula) | Ferramentas de Ciência Fina | 10099-15 | A maior extremidade tem que ser inclinada a 90° |
| Pinça de íris | |||
| Tecido de limpeza de lentes | THOR LABS | ||
| Filtro | diâmetro 7 cm | ||
| Lâminas de barbear | Microscopia eletrônica Ciências | 72000 | Para a lâmina |
| bisturi | |||
| feito em casa, o arquivo para impressão 3D é fornecido em Tesoura Cirúrgica de Material | |||
| Suplementar - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fatiador Vibratório | Thermo Scientific | 720-2709 | Modelo: HM 650V (Micrótomo de lâmina vibratória) |
| Banho-maria | Conjunto em 32 ° C (primeira etapa de recuperação) | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| para imagens de fatias | |||
| × 25 Objetiva de imersão em água de 0,95 NA | Leica Microsystems (Alemanha) | HCX Irapo | |
| Microscópio vertical MP5 de 2 fótons com scanners ressonantes (8 kHz) e dois detectores híbridos HyD | Leica Microsystems (Alemanha) | ||
| Bomba peristáltica digital Antlia-3C | DD Biolab | 178961 | Para perfusão em câmara de 2 fótons com aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti: laser de safira | Coerente (Alemanha) | ||
| pipetas de transferência descartáveis, boca larga | ThermoFischer científico | por exemplo: 232-11 | 5,8 mL com ponta de aleta, mas cortamos (aprox. 7 cm) para ter um filtro de emissão de boca de 4 mm de diâmetro |
| SP680 | Leica Microsystems (Alemanha) | ||
| cubo fluorescente contendo um filtro de emissão 525/50 e um filtro dicróico 560 (para coleta de fluorescência) | Béquer de vidro da Leica Microsystems (Alemanha) | ||
| com 50 mL de ACSF para manter a perfusão constante da fatia | |||
| Sistema de aquecimento | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | para manter a solução de perfusão a 32 > C |
| câmara | caseira, o arquivo para impressão 3D é fornecido em suporte de fatia de material suplementar | ||
| ("harpa") | em casa: grampo de cabelo feito de platina com os dois ramos unidos por fios de nylon paralelos | ||
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários |
| para estimulação de fatias | |||
| Adenosina 5′-trifosfato dissódico sal hidratado (ATP)Sigma | A-26209 | a ser preparado extemporaneamente : 1 mg/mL (3 mM) solução estoque preparada no dia do experimento, mantida a 4 &graus; C (algumas horas) e diluído antes do uso | |
| Fluoresceína (opcional) | Sigma | F-6377 | use em 1 µ M final |
| Micromanipulador | Luigs e Neumann | SM7 | conectado ao buraco da micropipeta |
| micropipeta | igual à eletrofisiologia | ||
| Cloridrato de serotonina | Sigma | H-9523 | alíquotas de solução estoque 50mM em H20 mantida a -20 °C. 500 µ M preparada no dia do experimento. |
| Seringa 5 mL (sem agulha) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Tubo transparente | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Tubulação não DEHP |
| < strong > Nome< / strong > | < strong > Empresa < / strong > | < strong > Número de catálogo< / strong > < | strong > Comentários < / strong > |
| < strong > para análise de imagem < / strong > | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Métodos (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Métodos (2012 |
| )Nome | Company | Número de catálogo | Comentários< |
| strong>camundongos | |||
| CX3CR1-GFP camundongos | Jung et al, 2000 | macho ou fêmea, P3 a 2 meses de idade; Retrocruzamos esses mouses no fundo 129SV. | |
| Camundongos CX3CR1creER-YFP | Parkhurst et al 2013 | machos ou fêmeas, P3 a 2 meses de idade; retrocruzamos esses camundongos no fundo 129SV. |
Referências
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origi....
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Reimpressões e permissões
