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通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

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DOI：

10.3791/58790

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2019年1月17日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

本文内容

摘要

本文介绍一种在单个亚端粒区域插入MS2序列标签以生成癌细胞克隆的实验方案。该方法基于MS2-GFP系统，可在活细胞中实现对单个端粒来源的端粒重复序列包含RNA（TERRA）内源性转录本的可视化观察。

摘要

端粒被转录产生含有端粒重复序列的长链非编码RNA（TERRA），据认为其在端粒生物学中发挥重要作用，包括异染色质形成和端粒长度稳态的调控。最新研究发现，TERRA分子还可与染色体内部区域相互作用，从而调控小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中的基因表达。与此证据一致，RNA荧光 原位 杂交（RNA-FISH）分析表明，仅有一部分TERRA转录本定位于染色体末端。深入理解TERRA分子的动态行为将有助于阐明其功能及作用机制。本文介绍了一种利用MS2-GFP系统在癌细胞中标记并可视化单个端粒TERRA转录本的方法。为此，我们提供了一项实验方案，以AGS人胃癌细胞系为例，构建稳定克隆，使其在单一亚端粒区整合MS2序列。当带有MS2标签的端粒转录产生TERRA时，会表达出带有MS2标签的TERRA分子；通过共表达与GFP融合的MS2 RNA结合蛋白（MS2-GFP），可在活细胞荧光显微镜下观察到这些分子。该方法使研究人员能够研究癌细胞中单个端粒来源TERRA分子的动态变化，并可推广应用于其他细胞系。 关键词：TERRA转录本，端粒，MS2-GFP系统，活细胞成像，RNA-FISH，AGS细胞系，染色体末端，单分子标记

引言

长链非编码RNA TERRA从染色体的端粒近端区域转录，其转录方向朝向染色体末端，并在端粒重复序列区域内终止1,2因此，TERRA 转录本的5'端包含由亚端粒区衍生而来的序列，并以端粒重复序列（在脊椎动物中为UUAGGG）结尾3TERRA 被认为在端粒处的异染色质形成中发挥重要作用4,5DNA复制6促进染色体末端之间的同源重组7,8,9，调控端粒结构10端粒长度稳态2,11,12,13此外，TERRA 转录本与小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）中大量端粒外位点相互作用，从而调控广泛的基因表达14与这些证据一致，RNA 荧光 原位 杂交（RNA-FISH）分析表明，仅有一部分TERRA转录本定位于端粒1,2,15此外，有报道称TERRA可在小鼠细胞中形成定位于X和Y染色体的核内聚集体2,16这些发现表明，TERRA 转录本在细胞核内经历复杂的动态变化。解析 TERRA 分子的动态特性将有助于阐明其功能及作用机制。

MS2-GFP 系统已被广泛用于在多种生物的活细胞中可视化 RNA 分子17,18。该系统先前已被用于标记并可视化酿酒酵母（S. cerevisiae）中的单个端粒 TERRA 分子12,19。利用该系统，最近的研究发现酵母 TERRA 转录本在双相生长转换后期定位于细胞质中，提示 TERRA 可能具有细胞核外功能20。我们近期已使用 MS2-GFP 系统在癌细胞中研究单个端粒的 TERRA 转录本21。为此，我们采用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将 MS2 序列整合至单个端粒（15号染色体长臂端粒，以下简称 Tel15q），并获得了表达 MS2 标记的内源性 Tel15q TERRA 的克隆（TERRA-MS2 克隆）。通过共表达一种与 GFP 融合的 MS2 RNA 结合蛋白（MS2-GFP），该蛋白可识别并结合 MS2 RNA 序列，从而实现在活细胞中对单个端粒 TERRA 转录本的可视化21。本方案的目的是详细描述生成 TERRA-MS2 克隆所需的各个步骤。

为构建TERRA-MS2克隆，需将MS2表达盒整合至15q端粒的亚端粒区，位于TERRA启动子区域及其转录起始位点的下游。该MS2表达盒包含一个两侧带有lox-p位点的新霉素抗性基因，其在15q亚端粒区的整合通过CRISPR/Cas9系统完成22。转染MS2表达盒后，筛选单克隆，并通过PCR、DNA测序和Southern印迹法验证表达盒在亚端粒区的正确整合。对阳性克隆感染表达Cre重组酶的腺病毒，以去除表达盒中的筛选标记，仅保留MS2序列和一个lox-p位点于15q亚端粒区。通过RT-qPCR验证来自Tel15q的MS2标记TERRA转录本的表达。最后，通过逆转录病毒感染在TERRA-MS2克隆中表达MS2-GFP融合蛋白，从而利用荧光显微镜观察MS2标记的TERRA转录本。使用端粒重复序列特异性探针，可通过RNA-FISH和活细胞成像清晰检测到TERRA转录本1,2,15,23。这些方法可在单细胞分辨率下提供TERRA分子总体定位的重要信息。在单一亚端粒区域含有MS2序列的克隆构建成功后，研究人员将能够研究活细胞中单个端粒来源的TERRA转录本的动态行为，从而有助于阐明TERRA的功能及其作用机制。

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方案

1 . 新霉素抗性克隆的筛选

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（每毫升培养基0.5单位）和链霉素（0.2 µg 每毫升培养基）于 37 °C 和 5% CO₂2以 1:10 的摩尔比将 sgRNA/Cas9 表达载体与 MS2 盒式元件共同转染至汇合度为 50–60% 的细胞中21.
    注意：在平行实验中，通过转染表达GFP的载体来验证转染效率（即， Cas9-GFP 载体）。转染效率应达到至少 60-70%。
  2. 次日，将培养基更换为含有0.7 mg/mL新霉素的培养基 µg/mL 终浓度（选择性培养基）。
    注意：转染后的第二天将细胞分装并接种至选择性培养基中，可加快筛选进程。所有未转染的细胞将立即死亡。若转染在6孔板中进行，则每孔在60%汇合度时约含有0.7 × 10⁶个细胞。6 细胞，次日可将细胞从单孔转移至含选择性培养基的10 cm培养皿中进行传代。
  3. 将细胞置于选择性培养基中培养7-10天，每1至2天更换一次培养基，直至可见单个克隆。
  4. 细胞克隆的挑选
    1. 准备一个96孔板，每孔含有10 µ每孔加入0.25%胰蛋白酶L。
      注意：若预计挑选的克隆数超过96个，请准备两块96孔板。
    2. 使用显微镜观察10 cm培养皿，用记号笔在皿底对每个可见克隆的位置进行标记，每个点对应一个待挑选的菌落。
    3. 更换培养基，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），仅需在克隆表面形成一层薄液膜，避免细胞在挑取克隆过程中干燥。
    4. 使用10挑取单个菌落 µL 移液器。将含有 5 的吸头连接 µ向克隆中加入适量胰蛋白酶，缓慢释放胰蛋白酶使其局限在克隆区域。作用1分钟使细胞脱落，然后用移液枪头轻轻刮取克隆，并将细胞吸至枪头中。
      注意：在该操作过程中，将培养皿略微倾斜一侧以减少待挑选克隆周围 PBS 的体积，可避免胰蛋白酶在克隆周围被稀释，从而有助于挑选操作。使用克隆环也有助于挑取单个克隆。
    5. 将菌落中的细胞放入含有10 μL培养基的96孔板的一个孔中 µ0.25% 胰蛋白酶 L
    6. 室温孵育 5 分钟，然后用 150 µL 选择性培养基（Ham's F-12K (Kaighn's) 培养基，添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（每毫升培养基 0.5 单位）、链霉素（0.2 µg 每毫升培养基，并含有浓度为 0.7 的新霉素 µg/mL
      注意：在孵育期间可同时挑选其他克隆。建议尽可能多地挑选克隆，挑选的克隆数量越多，越有可能鉴定出阳性克隆。
    7. 待所有克隆挑取并转移至96孔板后，将细胞置于含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）、链霉素（0.2 µg 每毫升培养基，并含有浓度为 0.7 的新霉素 µg/mL 37℃ °C 和 5% CO₂2，直至达到90%汇合度。
  5. 克隆的分离
    1. 准备三块经明胶包被的96孔板，每孔加入100 µ每孔加入 L 培养明胶，室温孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。这些培养板将用于 DNA 提取（DNA 板）和克隆冻存（冻存板）。
      注意：明胶可促进细胞和DNA在孔中的附着。特别是，在DNA提取和洗涤步骤（下文将讨论）期间，明胶包被有助于DNA黏附于孔底。在克隆分选操作过程中，建议使用多通道移液器。
    2. 当克隆细胞达到90%融合度时，从96孔板的每孔中吸除培养基，用PBS洗涤，每孔加入30 μL胰蛋白酶 µ每孔加入 0.25% 胰蛋白酶 L，于 37℃ 培育 5 分钟 °C.
      注意：克隆的生长速度各不相同，且取决于每个克隆挑选的细胞数量。因此，该步骤将在不同克隆陆续达到90%汇合度的数天内分批进行。
    3. 加入 70 µ每孔加入适量选择性培养基，通过在孔内反复吹打使细胞团块分散，然后转移30 µ100 分之 L µ加入120微升至预先装有凝胶化DNA的培养板中 µ每孔加入 L 的选择性培养基，并加入 30 µL 到预装有 50 的明胶化冷冻板 µL 培养基（不含筛选剂）
    4. 将 DNA 板放入培养箱中，使细胞在 37 °C 下生长 °C 和 5% CO₂2 直至90%汇合度。
    5. 加入80 µ将1 mL预冷的新鲜配制的2倍冻存液（80% FBS和20%二甲基亚砜（DMSO））加入冻存板的每孔中，用70%乙醇喷洒的封口膜覆盖在板上以密封各孔，盖上盖子，并用铝箔纸包裹整个冻存板。将冻存板置于-80 ℃条件下保存。 °C.
    6. 加入90 µ每孔加入适量选择性培养基至原96孔板中，该孔板含有已传代的克隆，继续培养直至获得PCR筛选结果。此孔板将用作备份板。

2. 新霉素抗性克隆的筛选

  1. 从96孔DNA板中提取DNA。
    1. 当 DNA 培养板中的克隆生长至 90% 汇合度时，用 PBS 洗涤 2 次，然后加入 50 µL 裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，10 mM EDTA，10 mM NaCl，0.5% SDS 和 1 mg/mL 蛋白酶 K）。用封口膜覆盖板子，密封每个孔，盖上盖子，再用保鲜膜包裹，置于 37 ℃ °C 过夜。
    2. 加入100 µ加入 100 µL 冷乙醇（Et-OH）/NaCl 溶液（100% 乙醇中含 0.75 M NaCl）至各孔，室温下沉淀 6 小时或过夜。
      注意：此处可暂停本实验方案。
    3. 倒置培养板以去除 Et-OH/NaCl 溶液，并用 200 μL 洗涤液洗涤 3 次 µ每孔加入 L 的 70% 乙醇。
    4. 加入25 µ在蒸馏水中加入 RNAse A 溶液，终浓度为 L，37℃孵育 °1 小时，37°C。
  2. 使用 3 µL 的基因组 DNA 用于 PCR 扩增。使用在新霉素抗性基因和 15q 亚端粒区内部结合的引物，对所选克隆进行 PCR 筛选。采用标准的聚合酶酶和 PCR 方案进行 PCR 扩增。21.
    注意：MS2引物（MS2-subtel15q-primer-S和MS2 primer AS）及CTR引物（CTR prime S和CTR primer AS）的PCR反应条件如下：98 °C，20 秒，作为变性步骤，然后进行 34 个循环：98 °C 10 秒，58°C 20 秒，72 °C 15 秒，使用聚合酶酶在 25 µL反应混合液（参见 材料表。引物序列见于 表 1.
  3. 在琼脂糖凝胶上进行PCR反应，并使用标准的凝胶回收程序从阳性克隆中回收获得的PCR条带（参见 材料表 用于凝胶回收试剂。
  4. 对凝胶回收的PCR产物进行DNA测序分析，以确认MS2序列的存在21.
    注意：测序分析可使用PCR筛选所用的引物进行。
  5. PCR阳性克隆的Southern印迹筛选
    1. 将经PCR和测序筛选呈阳性的克隆（来自原始96孔板的备份板）接种于6孔板中，使用添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）、链霉素（0.2 µg/mL 培养基）并含有 0.7 mg/mL 新霉素 µg/mL 37℃ °C 5% CO2.
      注意：或者，如果部分克隆已丢失，可从冻存板中选择一块进行复苏（参见方案 2.6）。
    2. 当克隆在6孔板中达到90%融合度时，用PBS洗涤细胞，并加入250 µ含有 0.5 的裂解缓冲液 L µ每孔加入蛋白酶K。
    3. 使用细胞刮刀刮取细胞，并将裂解液转移至1.5 mL离心管中。
    4. 37℃孵育 °16 小时，4°C
    5. 加入1 mL 100%乙醇，剧烈振荡，于-20℃放置至少2小时或过夜，使DNA沉淀 °C.
      注意：此处可暂停本实验方案。
    6. 在 4 °C 下以 13,400 x g 离心 °室温下以70%乙醇洗涤沉淀。弃去上清液后，将沉淀在室温下晾干。也可使用真空浓缩仪。
    7. 将DNA沉淀重悬于50 μL水中。 µ含 RNAse A 的 1 升蒸馏水，37 ℃孵育 1 小时 °C.
    8. 消化 5-10 µ使用 NcoI 和 BamHI 限制性内切酶（两次独立的消化反应）对 100 微克基因组 DNA 进行消化 µ37℃孵育消化反应，在L反应体系中进行 °C 过夜。
    9. 运行 4 µ在琼脂糖凝胶（0.8% 琼脂糖）上进行消化产物的电泳，以确认完全消化。
    10. 加入1/10体积的3 M、pH 5.2乙酸钠溶液和2体积的100%乙醇至限制性酶切反应体系中，于-20℃孵育至少2小时或过夜°C 以沉淀 DNA。
      注意：此处可暂停本实验方案。
    11. 在 4 °C 下以 13,400 x g 离心 °室温下离心20分钟，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。将沉淀在室温下空气干燥。或者，可使用真空浓缩仪干燥。
    12. 将沉淀物重悬于 20 µ加入适量蒸馏水，并将消化后的 DNA 加载至 0.8% 琼脂糖凝胶上。
      注意：为了获得更好的DNA消化片段分辨率，应制备至少15 cm长的凝胶，并在低电压下过夜电泳 ̴30 伏特）。电泳装置应进行优化。
    13. 次日，使用DNA标记试剂（如溴化乙锭）对凝胶进行染色，浓度为1 µL/10 mL 终浓度，室温孵育 30 分钟，使用凝胶成像仪拍摄凝胶照片，并将尺子置于凝胶旁。
    14. 将DNA转移至尼龙膜，并使用标准方法用特异性针对MS2序列的探针进行膜杂交21.
    15. 解冻两个冻存板中其中一个经PCR、DNA测序和Southern印迹鉴定为阳性的克隆（见下一步）。
  6. 克隆的解冻
    1. 准备一个15 mL离心管，其中含有5 mL预热的Ham's F-12K（Kaighn's）培养基，添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（0.5单位/毫升培养基）和链霉素（0.2 µ每克培养基需加入 g（每毫升培养基）以解冻每个克隆。
    2. 从-80℃取出一个冻存板° 并加入100 µ将预热的 F12K 完全培养基加入含有待复苏阳性克隆的孔中。
      注意：此操作应迅速进行，每解冻一个克隆后，应立即将96孔板放置于干冰上，以确保其他克隆保持冷冻状态。若需从同一96孔板中解冻多个克隆，此步骤尤为重要。
    3. 将细胞转移至含有5 mL培养基的15 mL离心管中，在室温下以800 × g离心5分钟。
    4. 吸弃培养基，将细胞重悬于 500 µ将预热的完全F12K培养基加入各克隆中，每克隆转移至12孔板中的单个孔内。
  7. 消除整合在15q亚端粒区MS2盒中的新霉素抗性基因
    1. 让克隆在完全F12K培养基中从12孔板扩增至10 cm培养皿中生长。
      注意：除非另有说明，培养基中不应添加新霉素。
    2. 将表达 Cre 的腺病毒加入到 10 cm 培养皿中处于 70% 汇合度的细胞中，培养基为 10 mL 完全 F12K 培养基。
      注意：使用表达 Cre-GFP 的腺病毒可评估感染效率，感染效率应接近 100%。复制缺陷型腺病毒在培养传代数次后将丢失。
    3. 感染后48小时，将细胞分至三个10 cm培养皿中。其中两个培养皿用于验证新霉素基因的去除：一个培养皿通过在含新霉素的培养基中培养细胞进行负筛选验证，另一个培养皿用于Southern印迹分析。
    4. 培养第三皿含有克隆的细胞，用于细胞冻存和RNA提取。

3. 通过RT-qPCR验证TERRA-MS2转录本的表达

  1. 在确认新霉素基因被移除后，使用有机溶剂（苯酚和异硫氰酸胍溶液）从TERRA-MS2克隆中提取总RNA21.
    1. 将从10 cm培养皿中提取的RNA重悬于100 μL中 µ二乙基焦碳酸酯（DEPC）水 L
    2. 运行 3 µ在含1%甲醛的1×3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）变性凝胶上电泳1 μL RNA，以检测RNA的浓度和完整性。同时使用分光光度计分析RNA浓度。
    3. 处理 3 µg RNA，使用60单位DNAse I酶进行DNAse I处理 µL 最终反应体积。
    4. 在37℃下孵育反应1小时 °C.
  2. 逆转录反应与qPCR分析
    1. 向无核酸酶的微量离心管中加入以下组分：2 µ1 L 的 µM TERRA 特异性引物，1 µL 的 dNTP 混合物（各 10 mM），6 µ经DNAse I处理的RNA的L（对应于） ̴300 ng RNA）。将体积调至 13 µL 与 4 µDEPC 水 L
      注意：对于每个待分析的RNA，应准备第二个含有相同试剂的试管，但使用参考特异性引物代替TERRA特异性引物。
    2. 将混合物加热至 65 °5分钟内降至室温，并在冰上孵育至少1分钟。
    3. 通过短暂离心收集各管中的内容物，并加入4 µ5X RT酶缓冲液L，1 µ0.1 M 二硫苏糖醇（DTT），1 µL（4单位）RNase抑制剂，以及1 µL 逆转录酶（参见 材料表).
    4. 将样品在 42 ℃ 孵育 °60 分钟，然后使用 2 µ用于 qPCR 分析的 RT 反应的 L。
  3. 准备qPCR反应体系，终体积为20 μL µL 由 10 组成 µ2 微升 2x qPCR 预混液，2 µcDNA模板L，1 µL 的正向引物（10 µM），1 µL 反向引物（10 µM）和6 µ升水
  4. 使用标准方案在热循环仪中进行qPCR反应21.

4. 表达 MS2-GFP 的逆转录病毒的制备

  1. 为生成表达 MS2-GFP 的逆转录病毒，将 80% 汇合度的 phoenix 包装细胞转染含有表达 MS2-GFP 融合蛋白的逆转录病毒载体（pBabe-MS2-GFP PURO）以及一个 环境 基因表达载体（如 pCMV-VSVG），两种载体的摩尔比为 4:1。
  2. 次日，将培养基（含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM）更换为含有10 mM丁酸钠的新鲜培养基。
  3. 在37℃孵育8小时 °C，5% CO2然后更换为新鲜的培养基，用于收集病毒。
  4. 48 小时后，从 phoenix 细胞中移除含有逆转录病毒的培养基。该培养基可直接用于 TERRA-MS2 克隆的感染；若如此操作，需将培养基通过 0.45 μm 滤器过滤。 µm 滤器，加入聚比烯（30 µg/mL 终浓度）并加入细胞中（在此情况下，本方案继续进行至步骤 5）。或者，可通过向 50 mL 离心管中加入 1/5 体积th 50% PEG-8000/900 mM NaCl 溶液的体积，并在 4 ℃下过夜孵育 °在旋转轮上。
  5. 次日，于 2,000 x g 离心 30 分钟以沉淀逆转录病毒颗粒，弃上清，将沉淀重悬于不含血清的 F12K 培养基中。
    注意：病毒颗粒可在1/100体积中重悬th 原始上清液体积的一部分。应进行感染测试，以确定有效感染细胞所需的逆转录病毒的最小体积。

5. 活细胞中 TERRA-MS2 转录本的可视化

  1. 将 TERRA-MS2 克隆细胞和野生型 AGS 细胞接种于玻璃底培养皿中。在感染当天，向培养基中加入聚凝胺（终浓度为 30 µg/mL）和表达 MS2-GFP 的逆转录病毒。
  2. 24 小时后，弃去含病毒的培养基，更换为不含酚红的新鲜培养基。
  3. 在倒置显微镜下使用合适的显微镜设置对细胞进行分析。采用高数值孔径（1.4X）的 100X 或 60X 物镜和高灵敏度相机（EMCCD）进行成像。使用环境控制系统，在成像过程中维持样品温度为 37 °C 和 5% CO2 。

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结果

图 1 展示了实验策略的总体示意图。图中显示了在 AGS 细胞中构建 TERRA-MS2 克隆的主要实验步骤及相应的时间安排（图 1A）。第 1 天，在 6 孔板的多个孔中转染 MS2 插入片段以及表达 sgRNA/Cas9 的载体（见 图 1B）。两条针对 15q 端粒旁区域的不同引导 RNA 序列被分别克隆至表达 Cas9 切口酶的 pX335 载体中，构建出两个 sgRNA-pX335 载体，并与 MS2 插入片段共同转染。其中一个孔可同时转染表达 GFP 的载体，用于检测转染效率。第 2 天，将细胞用胰蛋白酶消化，并从单个孔转移至含筛选培养基的 10 cm 培养皿中。第 3 天更换培养基，此时大多数未转染的细胞已死亡。此后细胞在筛选培养基中持续培养，直至可见单克隆形成并可进行挑取。在此期间，不应使...

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讨论

本文介绍一种生成含MS2序列的人类癌细胞克隆的方法，其中MS2序列已整合至15q亚端粒区域。利用这些克隆，可通过共表达MS2-GFP融合蛋白，利用荧光显微镜检测由15q亚端粒转录的MS2标记的TERRA分子。该方法使研究人员能够在活细胞中研究来自单个端粒的TERRA动态行为21。在本实验方案中，TERRA-MS2克隆选自AGS细胞系，该细胞系是研究TERRA的一个理想模型系统，因为TERRA在人类胃癌样本中的表达水平上调24。然而，本文所述方案可经调整后适用于其他细胞系中TERRA-MS2克隆的筛选。原则上，通过使用特异性的MS2表达盒和CRISPR策略，可将MS2序列整合至除15号染色体端粒以外的其他亚端粒区域。本方法中采用Cas9切口酶（nickase）和双导向RNA，以提高整合的特异性22。采用该策略，在AGS细胞中预计可鉴定出约2%的阳性克隆。也可尝试测试其他类型的Cas9酶，以提高克隆筛选的成功率25。此外，为最大化克隆筛选效率，需特别注...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益

致谢

我们感谢特伦托大学CIBIO先进影像中心以及维也纳马克斯·F·佩鲁茨实验室（MFPL）生物光学显微镜设施的工作人员。本研究工作获得了Mahlke-Obermann基金会以及欧盟第七框架计划（研究、技术发展与示范项目）的资助，项目编号为609431，授予EC。EC还获得了意大利教育大学与研究部（MIUR） Rita Levi Montalcini博士后奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AGS细胞--Christian Baron（Université 德蒙特é等）
F12K 营养混合物 1XGIBCO21127022AGS细胞培养基
L-谷氨酰胺 CORNINGMT25005CI细胞培养基成分
青霉素-链霉素溶液CORNING30-002-CI细胞培养基成分
胎牛血清Sigma AldrichF2442细胞培养基成分
DMEM 1XGIBCO21068028phoenix细胞培养基
CaCl2Sigma AldrichC1016用于凤凰细胞转染
HEPESSigma AldrichH3375用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
KClSigma AldrichP9333用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
葡萄糖Sigma AldrichD9434用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
NaClSigma AldrichS7653用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）和逆转录病毒沉淀
Na2HPO4Sigma AldrichS3264用于Phoenix细胞转染（HBS溶液）
1×胰蛋白酶EDTA溶液CORNING59430C用于细胞传代
DPBS 1XGIBCO14190250杜氏磷酸盐缓冲液
DMSOSigma AldrichD8418细胞冻存液组分（80% FBB 和 20% DMSO）
G-418 硫酸二氢盐福麦迪亚G4185筛选药物 
明胶溶液 生物试剂Sigma AldrichG139396孔DNA板的封板与冻存
Tris碱Fisher BioReagents10376743基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
EDTASigma AldrichE6758基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
SDSSigma Aldrich71729基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
蛋白酶K赛默飞世尔科技AM2546基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
RNA酶A赛默飞世尔科技12091021DNA 提取过程中的 RNA 降解
琼脂糖Sigma AldrichA5304DNA凝胶制备
Atlas ClearSightBioatlasBH40501用于在琼脂糖凝胶中检测DNA和RNA样品的染色试剂
乙醇Fisher BioReagentsBP28184DNA沉淀
乙酸钠 Sigma Aldrich71196用于在3M浓度、pH 5.2条件下进行DNA沉淀
Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统PromegaA9282从琼脂糖凝胶中提取PCR片段以进行新霉素阳性克隆的PCR筛选
TrizolAMBION15596018用于RNA提取的有机溶剂
Dnase I赛默飞世尔科技89836基因组DNA从RNA中的降解 
dNTPs 混合物Invitrogen10297018用于逆转录和PCR反应
DTTInvitrogen707265ML用于RT反应
焦碳酸二乙酯Sigma AldrichD5758用于以1:1000稀释度使水中的RNase失活
Ribolock赛默飞世尔科技EO0381RNase 抑制剂
MOPSSigma AldrichM9381RNA凝胶的制备
多聚甲醛电子显微镜科学公司15710变性RNA凝胶的制备（含1% PFA的1x MOPS）
Superscript III 逆转录酶Invitrogen18080-093逆转录反应
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PEG8000Sigma Aldrich89510逆转录病毒颗粒的沉淀
35µ玻璃底培养皿Ibidi81158用于TERRA-MS2克隆的活细胞成像分析

参考文献

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TERRA MS2 GFP RNA FISH TRF2 mCherry

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