Summary

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Published: January 17, 2019
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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Abstract

Telômeros são transcritas, dando origem a oligospermia repetição-contendo o tempo não-codificante RNAs (TERRA), que têm sido propostos para desempenhar um papel importante na biologia do telômero, incluindo formação de heterocromatina e homeostase do comprimento dos telômeros. Descobertas recentes revelaram que as moléculas TERRA também interagirem com regiões cromossômicas internas para regular a expressão gênica em células-tronco embrionárias (ES) do mouse. Em consonância com esta evidência, RNA fluorescência em situ hibridização RNA-análises mostraram que somente um subconjunto de TERRA transcrições localizar nas extremidades do cromossomo. Uma melhor compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação. Aqui, descrevemos um método para rotular e visualizar as transcrições TERRA single-telômero nas células cancerosas, usando o sistema MS2-GFP. Para este objetivo, apresentamos um protocolo para gerar clones estáveis, usando a linhagem de células de câncer de estômago humano AGS, contendo sequências MS2 integradas em um único subtelomere. Transcrição de TERRA do telômero MS2-tag resulta na expressão de moléculas TERRA MS2-marcados que são visualizados por microscopia de fluorescência de viver-pilha sobre co expressão de uma proteína RNA MS2-fundida a GFP (MS2-GFP). Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica de moléculas TERRA single-telômero nas células cancerosas, e pode ser aplicado a outras linhas de célula.

Introduction

O tempo não-codificante TERRA de RNA é transcrito da região subtélomérique dos cromossomos e sua transcrição prossegue em direção as extremidades do cromossoma, encerra-se no âmbito do trato repetição oligospermia1,2. Por esta razão, transcrições TERRA consistem em sequências de derivados de subtelomeric na sua extremidade 5′ e encerrar com repetições teloméricas (UUAGGG em vertebrados)3. Importantes funções têm sido propostos para a TERRA, incluindo a formação de heterocromatina telômeros4,5, DNA replicação6, promovendo uma recombinação homóloga entre cromossomo termina7,8 , 9, regulamenta o telômero estrutura10e telômero comprimento homeostase2,11,12,13. Além disso, transcrições TERRA interagirem com inúmeros locais de extratelomeric para regular a expressão gênica generalizada em rato de células estaminais embrionárias (ES)14. Em consonância com estas provas, RNA fluorescência em situ da hibridação análises (RNA-FISH) têm demonstrado que somente um subconjunto de transcrições TERRA localizar ao telômeros1,2,15. Além disso, a TERRA tem sido relatado para agregados nucleares de forma localizando nos cromossomos X e Y em células de rato2,16. Estes resultados indicam que as transcrições TERRA sofrer uma dinâmica complexa dentro do núcleo. Compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação.

O sistema MS2-GFP tem sido amplamente utilizado para visualizar moléculas de RNA em células vivas de vários organismos17,18. Este sistema tem sido anteriormente usado para tag e Visualizar moléculas TERRA single-telômero em S. cerevisiae12,19. Usando este sistema, recentemente foi demonstrado que as transcrições TERRA de levedura localizar dentro do citoplasma durante a fase de mudança de post-diauxic, sugerindo que a TERRA pode exercer funções extranuclear20. Recentemente nós usamos o sistema MS2-GFP estudar transcrições TERRA single-telômero em células de câncer21. Para este objectivo, que empregou a ferramenta de edição de genoma CRISPR/Cas9 integrar MS2 sequências em um único telômero (telômero 15q, doravante Tel15q) e obtidos clones expressando MS2-tag endógena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). Co a expressão de uma proteína GFP-fundido MS2 RNA-obrigatórias (MS2-GFP) que reconhece e liga MS2 RNA sequências permite visualização de transcrições TERRA single-telômero na vida células21. O objetivo do protocolo ilustrado aqui é descrever em detalhe os passos necessários para a geração de clones de TERRA-MS2.

Para gerar TERRA-MS2 clones, uma gaveta MS2 é integrada dentro da região de subtélomérique do telômero 15q, a jusante do TERRA promotor região e transcrição iniciar site. A MS2 gaveta contém um gene de resistência de neomicina ladeado por sites de salmão fumado-p, e sua integração no subtelomere 15q é executada usando o sistema CRISPR/Cas922. Depois de Transfeccao de gaveta, única clona o MS2 são selecionados e subtélomérique integração da fita é verificada pelo PCR, DNA, sequenciamento e Southern blot. Clones positivos estão infectados com um vírus adenoide Cre-expressando a fim de remover o marcador de seleção na gaveta, deixando apenas as sequências MS2 e um site único lox-p no subtelomere 15q. Expressão de transcritos TERRA MS2-tag de Tel15q é verificada por RT-qPCR. Finalmente, a proteína de fusão MS2-GFP é expressa em TERRA-MS2 clones através de infecção retroviral para visualizar as transcrições MS2-TERRA por microscopia de fluorescência. Transcrições TERRA podem ser facilmente detectadas por RNA-peixe e imagem latente da viver-pilha usando específicas repetição oligospermia sondas1,2,15,23. Estas abordagens fornecem informações importantes sobre a localização da população total de moléculas TERRA em resolução de célula única. A geração de clones contendo MS2 sequências em um único subtelomere permitirá aos pesquisadores estudar a dinâmica de transcrições TERRA single-telômero em células vivas, o que ajudarão a definir a função e os mecanismos de ação da TERRA.

Protocol

1. Seleção de Clones resistentes de neomicina Desenvolvem-se células AGS no meio de F-12_K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% de soro bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio) e estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) a 37 ° C e 5% de CO2. Transfect as células em uma confluência de 50-60% com a sgRNA/Cas9 expressando o vetor e o cassette MS2 em um 01:10 razão molar21.Nota: Em um experimento paralelo, verificar eficiência do …

Representative Results

Figura 1 representa uma visão geral da estratégia experimental. As principais etapas do protocolo e um calendário indicativo para a geração de clones de TERRA-MS2 em células AGS são mostradas (Figura 1A). No dia 1, vários poços de uma placa bem 6 são transfectados com o MS2 gaveta e sgRNA/Cas9 expressando vetores (mostrados na Figura 1B). Duas…

Discussion

Neste artigo, apresentamos um método para gerar clones de célula de câncer humano contendo sequências MS2 integradas dentro subtelomere 15q. Usando estes clones, as moléculas TERRA MS2-tag transcritas do subtelomere 15q são detectadas por microscopia de fluorescência pela expressão co de uma proteína de fusão MS2-GFP. Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica da TERRA, expressado de um único dos telômeros em vida células21. Neste protocolo, TERRA-MS2 clones são sel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos ao pessoal da instalação de imagem avançada do CIBIO para a Universidade de Trento e a facilidade de microscopia de luz de BioOptics na F. Max Perutz laboratórios (MFPL) em Viena. A pesquisa que conduz a estes resultados tem recebeu financiamento da Stiftung Mahlke-Anderson e o sétimo programa-quadro da União Europeia para a investigação, desenvolvimento tecnológico e demonstração no âmbito do acordo de concessão não 609431 CE. CE é apoiado por uma bolsa de Rita Levi Montalcini do Ministério da Educação Universidade e pesquisa (MIUR) italiano.

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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