यहां, हम विश्लेषण और संरचना और पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स के गठन के दृश्य के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । यह एंटीबॉडी आरएनए के विशाल दृश्यों का अधिग्रहण अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग शामिल है ।
एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन मांयता की अपार अनुकूलनशीलता अर्जित प्रतिरक्षा प्रणाली का आधार है । आणविक अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा एंटीबॉडी के विशाल प्रदर्शनों की प्रक्रिया के उत्पादन अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ के बावजूद, यह अभी तक एक पूर्ण एंटीबॉडी प्रदर्शनों की दर के एक वैश्विक दृष्टिकोण पर पहुंचने के लिए संभव नहीं किया गया है । विशेष रूप से, बी सेल रिपरटोयर्स एंटीबॉडी क्लोन की उनकी खगोलीय संख्या की वजह से एक ब्लैक बॉक्स के रूप में माना गया है । हालांकि, अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों सफलताओं को सक्षम करने के लिए बी सेल प्रदर्शनों की संख्या के बारे में हमारी समझ में वृद्धि कर रहे हैं । इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और पूरे व्यक्तिगत माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स विश्लेषण । प्रतिरक्षा अंगों से, मानव में चूहों और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में तिल्ली से प्रतिनिधित्व, कुल आरएनए तैयार किया गया था, रिवर्स transcribed, और 5 ‘-दौड़ विधि का उपयोग कर प्रवर्धित. एंटीबॉडी वर्ग विशिष्ट निरंतर डोमेन के लिए एक यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और एंटीसेंस प्राइमरों का प्रयोग, एंटीबॉडी mRNAs समान रूप से एंटीबॉडी आबादी में उनकी आवृत्तियों को दर्शाती अनुपात में परिलक्षित थे । amplicons अगली पीढ़ी अनुक्रमण (ngs), प्रतिरक्षा नमूना प्रति 10 से अधिक5 एंटीबॉडी दृश्यों से उपज द्वारा अनुक्रम थे । हम एंटीबॉडी अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन वी सहित (डी) जे जीन-खंड एनोटेशन, एक पक्षी है एंटीबॉडी प्रदर्शनों की श्रृंखला के नेत्र दृश्य, और हमारे कंप्यूटेशनल तरीकों ।
एंटीबॉडी प्रणाली अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली की बुनियादी बातों में से एक है । यह अत्यधिक अपने विशाल विविधता, ठीक प्रतिजन मांयता विशिष्टता के कारण रोगजनकों आक्रमण के खिलाफ शक्तिशाली है, और प्रतिजन विशिष्ट बी कोशिकाओं के क्लोनी विस्तार । एंटीबॉडी उत्पादक बी कोशिकाओं के प्रदर्शनों की एक एकल व्यक्ति1में 1015 से अधिक होने का अनुमान है । इस अपार विविधता इम्युनोग्लोबुलिन आनुवंशिक loci2में vdj जीन पुनर्संयोजन की मदद से उत्पंन होता है । पूरे बी सेल रिपरटोअर्स और antigen-प्रतिरक्षण के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तन का विवरण इसलिए चुनौतीपूर्ण है, लेकिन आक्रमण रोगजनकों के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है ।
उनकी खगोलीय विविधता के कारण बी सेल रिपरटोअर्स को ब्लैक बॉक्स माना गया है; हालांकि, ngs प्रौद्योगिकी के आगमन उनकी जटिलता3,4के एक बढ़ाया समझ के लिए सफलताओं सक्षम है । पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स सफलतापूर्वक विश्लेषण किया गया है, सबसे पहले zebrafish में5, फिर6चूहों, और मनुष्यों6,7. हालांकि NGS अब अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, समानताएं और व्यक्तिगत जानवरों के बीच एंटीबॉडी रिपरटोअर्स में मतभेदों के बुनियादी विश्लेषण की कमी है ।
चूहों में, यह बताया गया है कि IgM repertoires लगभग व्यक्तियों के बीच समान हैं, जबकि IgG1 और IgG2c के उन व्यक्तियों के बीच काफी अलग हैं8. वी के अलावा जीन उपयोग प्रोफ़ाइल, भोली परिधीय बी कोशिकाओं में VDJ-प्रोफाइल की मनाया आवृत्ति अत्यधिक8व्यक्तियों के बीच समान है । VDJ-क्षेत्र के अमीनो एसिड दृश्यों का विश्लेषण भी अलग चूहों में एक ही जंक्शन दृश्यों की घटना से अधिक बार पहले सोचा था कि8दिखाया । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एंटीबॉडी प्रदर्शनों की प्रक्रिया के गठन के लिए तंत्र के बजाय प्रसंभाव्य5,8,9निर्धारणात्मक हो सकता है । चूहों में एंटीबॉडी प्रदर्शनों की क्रिया विकास की प्रक्रिया को भी सफलतापूर्वक NGS का उपयोग करने के लिए और अधिक विस्तार से एंटीबॉडी प्रतिरक्षा प्रणाली को उजागर करने के लिए NGS की क्षमता को उजागर विश्लेषण किया गया है10।
इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और एक वैश्विक स्तर पर एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की रिपोर्ट का विश्लेषण ।
विधि यहां वर्णित एंटीबॉडी आरएनए के लिए NGS का इस्तेमाल 5 ‘-दौड़ विधि का उपयोग प्रवर्धित । के विपरीत विधियों का उपयोग करें कि अपभ्रष् ट 5 ‘-VH जीन primers, प्रत्येक एंटीबॉडी वर्ग के mrnas समान रूप से परिलक्षित होते है सार्वभौमिक आगे primers का उपयोग कर । इसके अलावा, एंटीसेंस के उपयोग के लिए विशिष्ट प्राइमरों स्थिरांक-क्षेत्र 1 (CH1) एंटीबॉडी जीन के विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन कक्षाओं के प्रदर्शनों की रूपरेखा सक्षम बनाता है । यह वर्ग विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया विदारक के लिए बहुत फायदेमंद है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में भोली और प्रतिरक्षित repertoires8,9की तुलना के लिए ।
इस विधि का सबसे संभावित रूप से होने वाला नुकसान प्रवर्धित इम्युनेस्टोबुलिन संदेशों की कमी है । इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एंटीबॉडी रिपरटॉयर की गहराई काफी हद तक चरण ३.१ और ३.२ में वर्णित पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करती है । यदि रिपरटॉयर गहराई ठीक से प्राप्त नहीं है, कदम 3.2.1 या 3.2.2 में टेम्पलेट cdna और प्राइमरों के अनुपात में परिवर्तन दृढ़ता से सिफारिश की है.
आम तौर पर, NGS द्वारा उत्पादित एंटीबॉडी पढ़ता का लगभग 20% अस्पष्ट दृश्यों21हैं । यहां तक कि स्थापित “सुधार विधियों” के साथ, 5-10% अस्पष्ट3रहते हैं । इसलिए हम, अनुक्रम और फ़िल्टर्ड कच्चे हस्ताक्षर इम्युनोग्लोबुलिन निरंतर क्षेत्रों (cμh1, Cγ1H1, Cγ2cH1, आदि) के अनुरूप दृश्यों युक्त पढ़ता विश्लेषण किया । इसलिए दैहिक हाइपर-म्यूटेशन के विश्लेषण के लिए सावधान परीक्षाओं की जरूरत होती है.
इस विधि की सीमाओं में से एक यह है कि इम्युनोग्लोबुलिन भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़ी inferred करने में असमर्थ है । इसलिए इस विधि द्वारा प्राप्त प्रदर्शनों की दृष्टि समग्र नहीं है । हालांकि, यह डेटा10के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा शीर्ष रैंकिंग जोड़े अनुमानित करने के लिए संभव है । इसके अलावा, इम्युनोग्लोबुलिन जोड़े अनुक्रम करने के लिए एक उपंयास विधि हाल ही में3,4की सूचना दी थी ।
इम्युनोग्लोबुलिन आउटपुट में अनुक्रम. fna डेटा इम्युनोग्लोबुलिन जीन हस्ताक्षर दृश्यों की उपस्थिति के आधार पर निकाले गए. इसके बाद वी, डी, और जे जीन सेगमेंट को एनोटेटेड किया गया और वी (डी) जे पुनर्व्यवस्था की उत्पादकता का आकलन किया गया. पूरकता-निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) दृश्यों को भी एनोटेटेड किया गया । . fna डेटा में इम्युनोग्लोबुलिन दृश्यों की इन व्यवस्थित परीक्षाओं के लिए उपयोगी imgt/highv-क्वेस्ट सर्वर22,23,24द्वारा प्रदान किए गए थे । हालांकि, एक स्वचालित प्रसंस्करण पाइप लाइन के निर्माण के लिए बड़े प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण करने के लिए योग्यता है । पाइपलाइन प्रत्येक उद्देश्य के लिए अनुकूलित स्टैंडअलोन IgBLAST प्रोटोकॉल19का उपयोग करके स्थापित करने के लिए संभव है । यह दृष्टिकोण बुनियादी प्रोग्रामिंग साक्षरता की जरूरत है, लेकिन इम्युनोग्लोबुलिन प्रणाली का विस्तृत विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी है । वर्णित पाइपलाइनों अनुकूलित प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के उदाहरण हैं ।
एंटीबॉडी पढ़ता की संख्या नमूना में एंटीबॉडी rnas की राशि के लिए आनुपातिक है, प्रतिरशि के घटकों को दर्शाते समय अंक5,8,25पर एंटीबॉडी सिस्टम । यहां वर्णित विधि वी (डी) जंमू एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची का उपयोग कर के एक पक्षी के नेत्र देख देता है आर कार्यक्रम8,18,26।
व्यक्तिगत भोली चूहों के IgM एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की वैश्विक दृष्टि से IgG1 या IgG2c8के उन लोगों की तुलना में एक अत्यधिक संरक्षित vdj-प्रोफ़ाइल का पता चला । यह बताया गया है कि अपरिपक्व zebrafish के vdj संयोजन अत्यधिक टकसाली9रहे हैं । इसके विपरीत, मानव VDJ संयोजन करने के लिए अत्यधिक विषम6सूचित कर रहे हैं. भोले बी कोशिकाओं में अत्यधिक संरक्षित निर्धारणात्मक VDJ-प्रोफाइल शायद या तो विषम VDJ द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं-rearrangements या ऑटो के साथ नकारात्मक चयन-शरीर में प्रस्तुत एंटीजन. उदाहरण के लिए, IGHV11-2 भ्रूण igm प्रदर्शनों की क्रिया27 में बेहतर ढंग से व्यक्त की है और इस प्रबलता IGHV11 की autoreactivity के लिए जिंमेदार ठहराया है-2 सेनेसेंट एरिथ्रोसाइट्स के खिलाफ27। दिलचस्प है, IGHV11-2 भी भोले IgM8के हमारे पहले प्रकाशित विश्लेषण में सबसे आम प्रमुख प्रदर्शनों की खबर थी ।
यहां वर्णित विधि एंटीबॉडी-रिपरटॉयर व्यक्तिगत निकायों में उत्पन्न अंतरिक्ष का विश्लेषण करके antigen-उत्तरदायी एंटीबॉडी रिपरटोअर्स गूढ़ रहस्य के लिए उपयोगी है, कुंजी एंटीबॉडी प्रदर्शनों की जाँच8के असावधानीवश चूक से बचने, 10. इस विधि भी विस्तृत एंटीबॉडी नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा है, जो नए उभरते रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षात्मक एंटीबॉडी की त्वरित खोज की सुविधा होगी की अनुमति देता है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम अनुदान संख्या JP18fk0108011 (KO और SI) और JP18fm0208002 (टीएस, KO, और यो) के तहत एमएड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (15K15159) से अनुदान में सहायता को KO । बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए हम सय्री यामागुची और सतोको ससाकी को धन्यवाद देते हैं । हम अंग्रेजी भाषा संपादन के लिए एडीटेज (www.editage.jp) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |