Sæd samling av differensial kvalitet bruker tetthet gradert sentrifugering

Summary

I dette papiret, vi tar sikte på å beskrive tetthet gradert sentrifugering teknikken og dens anvendelse i sperm fysiologi forskning.

Abstract

I seksuell reproduksjon, en mannlig Kjønnscelle eller sperm celle sikringer med en kvinnelig Kjønnscelle å få befruktning. Et stort antall sædceller med gjødsling evne kreves imidlertid å samhandle med en kvinnelig Kjønnscelle å sikre befruktning. Slik er gjødslende evne til individuelle sædceller avgjørende for vellykket reproduksjon. Tetthet gradert sentrifugering blitt benyttet i flere tiår som reproduserbare, rask, effektiv og ekstremt fleksibel metode for å samle inn bare høy kvalitet sperm i Assistert befruktning. Protokollene vi beskrevet her fokus på utnyttelse av usammenhengende Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) teknikken å isolere tre forskjellige populasjoner av hane sæd ved sin kvalitet. Vi kunne samle lite, middels og høy kvalitet sperm. Vi beskriver også reproduserbar protokoller som innebærer avgjørende fruktbarhet potensialet av sæd ved å vurdere deres levedyktighet, mobilitet og penetrability. Samling av sæd av kvaliteten bruke PDGC teknikken ville være nyttig å nøyaktig og grundig karakterisere sperm med differensial fruktbarhet potensielle.

Introduction

I virveldyr gjennomgå mannlige gameter intens seleksjonspress; Derfor er reproduktive fitness om menn avgjørende for å oppnå vellykket befruktning. Menn av Alle virveldyr artene må kunne produsere sædceller i store mengder og av tilstrekkelig kvalitet for å møte behovene til befruktning. Sædceller, har både en sædceller hode og en flagell, er de mest polarisert cellene i kroppen. De er også svært heterogen i kvaliteten på sæden (levende og døde morphologically normale og unormale og immobile, lav mobile og høy mobil), som er avdekket gjennom variasjonen i reproduktive effektiviteten av menn. Jo større andel av høy kvalitet sperm, mengde parring må vellykket gjødsle ovum. Men for å oppnå fruktbarhet, morphologically normal sædceller stole på propulsive styrker generert av deres flagella å komme til stedet for befruktning så vel som å trenge gjennom zona pellucida¹ (ZP; i pattedyr) eller indre perivitelline Lag² (IPVL, fugler og reptiler) av egget etter naturlig mating eller kunstig insemination (AI). Bestemme sperm kvalitet er nødvendig for bruk i assistert reproduktive teknologier³ (ART) og utvalg av avl menn i AI programmer⁴. Derimot, avhengig suksess for kunst utelukkende av nøyaktig vurdering av kvaliteten. En rekke laboratorietester er utviklet for å fastslå funksjonelle egenskaper av sæd. De viktigste parameterne er sperm morfologi, levedyktighet, mobilitet, capacitation (avian sperm krever ikke capacitation⁵), acrosome reaksjon (AR; exocytosis og utgivelsen av et proteolytisk enzym fra acrosome av sæden hodet), sperm penetrasjon ZP eller IPVL, og gjødsling^{6,7,8,9,10,11}. Tiltak av fruktbarhet alene gi ikke en nøyaktig vurdering av gjødslende evnen til en sæd befolkningen¹¹. Tiltak av flere hendelser som førte til befruktning av et egg gir en riktig representasjon av ytelsen til enkelte spermatocytes⁷.

Metodene som er utviklet for å måle sperm funksjon er primært artsspesifikke. For eksempel i avian sperm er levedyktighet, mobilitet og penetrasjonen av IPVL de vanligste parameterne brukes til å vurdere sperm kvalitet^8,11,12. Antall levende sædceller i ejakulere spiller en avgjørende rolle for overlevelse av spermier fordi tilstedeværelsen av et stort antall døde sperm i sæd påvirker kvaliteten på sæden. Dette øker produksjonen av reaktive oksygen arter i sæd til oksidative skader den levende sædceller¹³. Sperm mobilitet, kapasiteten for flagellar flytting av avian sæd mot motstand ved kroppstemperatur, er kjent for å spille en direkte rolle i å bringe om befruktning⁸. Det er godt etablert at mobilitet er positivt korrelert med fruktbarhet og er derfor en primær determinant av fruktbarhet⁸. En mobil sperm må imidlertid også ha muligheten til å gjennomgå en AR og trenge IPVL¹¹. IPVL penetrasjon analyser ta hensyn til alle sædcellene som deltar i prosessen med befruktning¹¹.

Anvendelsen av kunst, er ejakulerer vanligvis behandlet for å maksimere konsentrasjonen av høy kvalitet sperm og minimere konsentrasjon av lav kvalitet sperm. Etter samling av sæd, kan andelen av høy kvalitet sperm bli beriket gjennom sperm separasjon prosedyrer brukt i både industri og forskning. Mange av disse prosedyrer har blitt utviklet, med respektive fordeler og begrensninger, men alle utnytte heterogene natur sædcellene å samle bare sperm med høy gjødslende evne. Disse prosedyrene omfatter sperm overføringsmetoder, tilslutning kolonnen filtrering og tetthet gradert sentrifugering (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. blant de tilgjengelige teknikkene, DGC er funnet for å være svært enkel, repeterbare, kostnadseffektiv og effektiv hjelpe maksimale høykvalitets sæd til bruk i kunst med mål om å maksimere sjansen for befruktning^{14 , 15}. I tillegg DGC er ikke skadelig for sperm celle membran. Derimot sperm overføringsmetoder samle bare gradvis mobile sperm^18,19, men mengden av sæd samlet er svært lav, noe som gjør det ineffektivt å samle inn store mengder sæd^{18, 20}. tilslutning kolonnen filtrering er svært effektiv i filtrering ultramobile sperm fra sæd¹⁷; men pleier det å være skadelig for sperm membraner^20,21.

I DGC teknikken er mest brukte underlaget for å generere tetthet graderingen Percoll, som består av kolloidal silika partikler belagt i polyvinylpryrolidone. Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) kan enten være kontinuerlig eller usammenhengende men usammenhengende graderinger brukes vanligvis for høy avkastning isolering av svært mobile sperm^13,16,20. I en usammenhengende gradering flyter lavere tetthet media over høyere tetthet medier, lage en gradering som øker tetthet fra toppen til bunnen av en konisk rør. Dette skaper grenser på grensesnittet mellom to media av ulik tetthet. Effektiviteten av PDGC er avledet fra to faktorer: 1) propulsive evne til individuelle sperm celler og 2) tendensen av sædceller med høy strukturelle integritet å ha en økt tetthet. Spermier med høyere mobilitet er bedre i stand til å krysse fra lavere tetthet media og trenge inn i en høyere tetthet media. Lavere mobilitet sæd er mer sannsynlig å bli fanget på grensen laget av grensesnittet mellom media av ulik tetthet. Sædceller med høy strukturelle integritet og mobilitet pleier å ha en høyere tetthet enn døde, unormal eller lav mobile sædceller. Når sentrifugalkraften brukes i PDGC, forenkler dette flytting av sæd med forskjellige tettheter til sitt respektive i forløpningen.

I generell fremgangsmåte når PDGC er utført, den myke pellet av spermier med høy fruktbarhet potensielle nederst konisk røret samles og resten er forkastet. Men er en underutnyttet fordel av denne teknikken dens evne til å skille sædceller i flere grupper basert på kvalitet forskjellene. Til forskningsformål tillater separasjon av sæd ved grad av kvalitet utnytte PDGC teknikken studie av kvaliteten som gjelder fysiologiske, metabolomic og proteomic forskjeller. Her, ønsker vi å detalj hvordan denne teknikken kan brukes til å skille sperm kvalitet, i tillegg til å vise disse forskjellene i kvalitet, bruk av tidligere etablert eosin-nigrosin viktig flekker for levedyktigheten Accudenz analysen for mobilitet og sperm-IPVL samhandling analysen for penetrability.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Georgia. 1. vask med tradisjonelle sentrifugering Forberede fosfat buffer løsning (PBS). Legge 8.0 g av NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann (dH2O). Justere pH 7,4 bruker 0,1 N HCl og få løsningen til 1 L bruker dH2O. Forberede motilitet buffer. Legge 6…

Representative Results

PDGC teknikken resulterte i forskjellige separasjon av tre lag av sæd ved grad av kvalitet over alle parametere. Sperm skiller til høy kvalitet lag under høyere tetthet løsningen, et middels kvalitet lag mellom høyere og lavere tetthet løsning og en lav kvalitet lag over lavere tetthet løsningen. Disse forskjellene i kvalitet er dokumentert av klare forskjeller i levedyktighet (Figur 4), transportabel (figur 5) og penetrab…

Discussion

Fruktbarhet ikke bare bestemmer lønnsomheten i dyr produksjonen, men også fungerer som en naturlig utvalg av arter for eksistens. Den ultimate funksjonen til en sperm celle er å befrukte egget. Oviduct en kvinne velger bare de fittest sperm slik befruktning av egget^23,24. In vitro studier har også avdekket en nær sammenheng mellom kvalitativ sædceller egenskaper og gjødsling, suksess,^4,,¹¹…

Materials

Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found