Здесь мы представляем протокол разработки и характеристики модели эпилепсии рыбок данио, возникающую в результате преходящего ингибирования гена DEPDC5.
Эпилепсия представляет собой одно из наиболее распространенных неврологических расстройств, затрагивающих, по оценкам, 50 миллионов человек во всем мире. Недавние достижения в области генетических исследований выявили большой спектр генов, причастных к различным формам эпилепсии, подчеркивая гетерогенную природу этого расстройства. Соответствующие животные модели необходимы для исследования патологических механизмов, вызванных генетическими мутациями, замешанными в эпилепсии, и для разработки специализированных, целевых методов лечения. В последние годы рыбки данио стали ценным позвоночным организмом для моделирования эпилепсии с использованием как генетических манипуляций, так и воздействия известных эпилептогенных препаратов, таких как пентилентетразол (PTZ), для выявления новых противоэпилептических терапевтических средств. Вредные мутации в регуляторе mTOR DEPDC5 были связаны с различными формами фокальной эпилепсии и сбитием ортолога рыбок данио, вызывающих гиперактивность, связанную со спонтанными приступообразными эпизодами, а также повышенную электрографическую активность и характерное плавание с поворотным колесом. Здесь мы описали метод, участвующий в создании модели потери функции DEPDC5 и проиллюстрировали протокол оценки двигательной активности через 28 и 48 ч после оплодотворения (hpf), а также метод регистрации полевой активности в зрительном тектуме рыбок данио. Также приведена иллюстрация влияния эпилептогенного препарата PTZ на активность нейронов с течением времени.
Благодаря своим небольшим размерам, яйцекладу и прозрачности на ранних стадиях развития, рыбка данио стала ценным позвоночным организмом для моделирования заболеваний человека, столь же разнообразных, как сердечно-сосудистые, онкологические или неврологические расстройства1,2. Рыбка данио сочетает в себе преимущества позвоночных, в том числе высокую сохранность архитектуры органов и генетического кода, с небольшим размером и простотой генетических манипуляций с более простыми модельными организмами, что облегчает как фундаментальные исследования, так и трансляционные приложения. В частности, его поддаться высокопроизводительному автоматизированному скринингу поведения и флуоресцентным маркерам клеточных процессов сделала рыбок данио особенно привлекательной моделью для исследований эпилепсии. Это было продемонстрировано высоким увеличением в последнее десятилетие числа публикаций, включающих химически индуцированные и/или генетические модели эпилепсии3,4, 5и, в последнее время, сообщения о перспективныхтерапевтических средствах, полученных из химических экранов в этих моделях6,7,8.
DEPDC5 является членом комплекса GATOR1, отрицательного регулятора сигнализации mTOR9. Мутации в гене DEPDC5 были впервые обнаружены в 2013 году у пробандов, страдающих аутосомно-доминантными фокальными эпилепсиями10,11,и с тех пор были зарегистрированы в ряде клинических состояний, связанных с очаговыми эпилептическими проявлениями и фокальной кортикальной дисплазией12. Подавляющее большинство зарегистрированных мутаций, по прогнозам, вызывают потерю функции гена12,и это было официально продемонстрировано для ряда мутированных транскриптов DEPDC5, которые нацелены на бессмысленный опосредованный распад мРНК12,13. В согласии, сбивание гена-ортолога у рыбок данио с использованием антисмысловых морфолиноолиголидов (АМО) приводит к ряду особенностей, которые являются общими для эпилептических моделей в этом организме, включая гиперактивность, поворотно-подобное плавание, спонтанные судороги и повышенную нейрональную активность14,15,16,17,18. Интересно, что лечение рапамицином, ингибитором передачи сигналов mTOR, обратило вспять поведенческие особенности этой модели18,поддерживая гипотезу о том, что потеря функции DEPDC5 может вызвать эпилепсию из-за неправильной регуляции пути mTOR9,19.
Преходящее сбивание экспрессии генов in vivo с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, несущих морфолинодедирование, стало бесценным инструментом для изучения роли специфических генов наравне с методами на основе si/shRNA. В последнее время стратегии, основанные на АМО, также нашли клиническое применение, причем первая АМО-терапия получила одобрение FDA для лечения мышечной атрофии Дюшенна в 2016году 20. Хотя сообщалось, что у рыбок данио фенотип острого нокдауна генов на основе АМО не всегда коррелирует с конститутивными нокаут-моделями21,это может быть связано, по крайней мере, в некоторых случаях с компенсаторными механизмами, порожденными конститутивными генетическими модификациями22. Однако вопрос о специфичности фенотипа, индуцированного АМО, является бесспорным вопросом, который должен быть усердно рассмотрен в исследованиях с использованием этой технологии23. Чтобы обеспечить специфичность нокдаун-фенотипа на основе AMO, необходимо несколько ключевых элементов управления. К ним относится кривая доза-реакция, которая позволяет выбрать самую низкую дозу AMO, эффективную для сбивания генов, избегая общей токсичности из-за введения избытка генетического материала. Использование Mismatch AMO, который не нацелен на какую-либо конкретную область в геноме, также требуется для установления соответствующей дозы и идентификации конкретного фенотипа. Второй AMO, который нацелен на другую область того же гена, такую как AMO, блокирующий сращивание, необходим для подтверждения того, что фенотип обусловлен сносом гена-мишени. Спасение нокдауна фенотипа с кДНК гена, либо человеческого ортолога, либо кодон-модифицированной версии гена рыбки данио, которая не может быть нацелена на AMO, дает веский аргумент в пользу специфичности фенотипа. Отсутствие спасения с той же кДНК, содержащей мутации потери функции (такие как введение кодонов ранней остановки), является еще одним доказательством в этом направлении.
Здесь мы представляем метод генерации модели потери функции рыбок данио DEPDC5 и протокол поведенческого фенотипирования через 28 и 48 ч после оплодотворения (hpf). При 28 л.с. потеря функции DEPDC5 вызывает общую гиперактивность, о чем свидетельствует усиленное сворачивание и подергивание движений эмбрионов внутри хориона. Автоматизированная система обнаружения движения может быть использована на этом этапе для количественной оценки общей активности на эмбрион. При 48 л.с. рыбки данио демонстрируют стереотипное побег, плавая в ответ на прикосновение. У рыбок данио с пониженной экспрессией DEPDC5траектория плавания значительно более извилиста, чем у контрольных, рыба демонстрирует «пробковый винт» или «поворотное колесо», подобное рисунку, аналогичному другим зарегистрированным моделям эпилепсии в этом организме3,4. Электрофизиологические записи были получены в зрительном тектуме у личинок рыбок данио между 4-6 днями после оплодотворения (dpf) и показали базовое увеличение активности нейронов у животных DEPDC5. Преимущество этой модели заключается в том, что она представляет несколько фенотипических особенностей в разные моменты времени, которые могут быть полезны при мониторинге и оценке эффективности лекарственной терапии во время разработки.
Эпилепсия является сложным неврологическим заболеванием, отличающимся широким спектром этиологий, которые начинают выясняться с появлением технологий генетического секвенирования25,26,27. Универсальные животные модели необходимы для эффективной трансляционной стратегии, которая даст как понимание патологических механизмов генетически связанных эпилепсий, так и таргетную терапию для различных форм этого состояния. Модели рыбок данио были очень эффективны в воспроизведении основных признаков эпилепсии и обеспечении надежных показаний для скрининга противоэпилептических препаратов5,28. Спонтанные судороги могут быть обнаружены у генетически модифицированных рыбок данио15,29,30,31 и нейрофизиологический анализ в этих моделях28 подтвердил нейронную основу эпилептикоподобного поведения32,33. Малогабаритные личинки рыбок данио поддаются химическим экранам в формате 96 скважин с использованием автоматического обнаружения простого поведения, такого как спонтанное плавание, что позволяет быстро обнаруживать потенциальные терапевтические средства.
Представленная здесь модель детона DEPDC5 получена путем инъекции AMO в эмбрион рыбки данио для блокирования экспрессии генов во время развития. Эта модель представляет несколько ключевых фенотипических особенностей в разные временные точки развития личинок, которые могут быть использованы в качестве показателей эффективности терапии во время протокола химического или генетического скрининга. Нокаут гена, опосредованный АМО, является мощным методом, демонстрирующим преимущества перед химически индуцированными моделями судорог, поскольку он специально нацелен на экспрессию интересующего гена, что позволяет идентифицировать основные патогенные механизмы, вызванные генетической мутацией. Химические индуцеры, которые, тем не менее, являются мощными инструментами для скрининга лекарств, могут действовать через несколько клеточных путей, которые не всегда могут быть связаны с изучаемой генетической мутацией. Хотя инъекция АМО сама по себе является простой техникой, когда она осваивается экспериментатором, она также представляет ряд ограничений. Инъекции должны быть выполнены на стадии одной клетки эмбриона; в наших руках инъекции на более поздних стадиях значительно увеличивались вариабельность фенотипа. Это ограничивает время, доступное для инъекций; поэтому полезна стратегия генерации яйцеклеток для инъекций во временной последовательности. Мы обычно используем 4-5 крестов, которые мы открываем с интервалом 15-20 минут, позволяя впрыскивать одно сцепление перед получением следующего. Кроме того, необходимо позаботиться о том, чтобы оценить фенотип в одних и тех же точках между различными экспериментами, поскольку стереотипное поведение быстро развивается в течение первых дней развития. Объем и концентрация АМО также должны тщательно контролироваться, так как общая токсичность из-за инъекций чрезмерных количеств будет маскировать конкретный фенотип. Различные контрольные элементы, представленные во введении, необходимы для определения правильной дозы инъекции и соответствующего фенотипа.
Полевые записи мозга личинок рыбок данио являются полезным инструментом для исследования вредных последствий генетических мутаций, участвующих в различных расстройствах мозга, на глобальную активность нейронов34. События деполяризации, наблюдаемые в этих экспериментальных условиях, являются устоявшимся методом оценки электрофизиологического воздействия лекарственных средств в различных эпилептических условиях15,35. Однако оценка этих эффектов в основном проводилась качественно, а не количественно, и в качестве субъекта анализа был установлен субъективный наблюдатель. Здесь мы разрабатываем автоматическую стратегию обнаружения, которая может объективно количественно оценить скорость деполяризации, их амплитуду и продолжительность, а также может оценить прогресс этих параметров во времени или с различными генетическими или фармакологическими вмешательствами.
Репрезентативные результаты, представленные здесь, показывают ожидаемую полевую активность генетической модели DEPDC5 по сравнению с контролем несоответствия у рыбок данио 4-6 dpf до и после применения PTZ для введения эпилептиформной электрографической активности. Ранее мы показали значительное увеличение базальной активности депонирования DEPDC5 при условии18. Здесь мы показываем, что реакция этих двух условий на PTZ, химический индуктор эпилептиформной активности, имеет аналогичную траекторию во времени, начиная с периода относительно низкой частоты, событий деполяризации с высокой амплитудой и продолжая периодом событий деполяризации с более высокой частотой, более низкой амплитудой. События полевой записи имеют медленную динамику (интересуемые частоты находятся в диапазоне 0,005-0,2с-1),поэтому для изоляции интересующих событий используются как фильтры нижних, так и высоких частот. После устранения низкочастотного шума обнаружение событий деполяризации осуществляется с помощью простого порога. Поскольку на статистику сигнала сильно влияет наличие событий деполяризации, мы не могли использовать стандартное отклонение общего сигнала для определения этого порога. Изменчивость значения стандартного отклонения между наборами данных была больше, чем наблюдаемые уровни регистрируемого шума. Поэтому после визуального осмотра следов мы использовали фиксированное значение порога 0,3 мВ, чтобы избежать смещения, вызванного разными уровнями деполяризационной активности.
Описанный протокол обеспечивает стандартизированный и простой метод оценки двигательного поведения и активности нейронного поля посредством регистрации напряжения внеклеточного тока в сочетании с автоматическим обнаружением событий деполяризации в зрительном тектуме для характеристики эпилептиформоподобных фенотипов в моделях рыбок данио.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников электрофизиологической платформы ICM, где проводились нейрофизиологические эксперименты. Мы также благодарим Anca Marian за техническую помощь. SC был поддержан грантом на батуте No 21488. EK был поддержан грантом AFM No 18469 и грантом ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC был поддержан наградами PhD от Фонда медицинских наук (PLP20141031462) и ARSLA. Для AD и RM эта работа была поддержана тремя грантами от Национального управления по научным исследованиям и инновациям Румынии, CNCS-UEFISCDI (номера проектов PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 и COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), грантом исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 – грантовое соглашение No 668863-SyBil-AA и грантом Национального научного фонда NSF-IOS-1656830, финансируемым правительством США.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |