हम यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए cytotoxicity की जांच पूर्व सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं के खिलाफ कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के द्वारा अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं के माध्यम से वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी. इस प्रोटोकॉल माइलॉयड सेल के पीछे तंत्र की जांच कर सकते हैं-प्रेरित टी सेल दमन और प्रतिरक्षा दमन माइलॉयड कोशिकाओं की नाकाबंदी के माध्यम से टी कोशिकाओं की भरपाई के उद्देश्य से यौगिकों का मूल्यांकन ।
ट्यूमर के Potentiation-हत्या की क्षमता के ट्यूमर में सीडी 8+ टी कोशिकाओं, उनके कुशल ट्यूमर घुसपैठ के साथ-साथ, सफल immunotherapies का एक प्रमुख तत्व है । कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि ट्यूमर माइलॉयड कोशिकाओं घुसपैठ (उदाहरण के लिए, माइलॉयड-व्युत्पंन दमन कोशिकाओं (MDSCs) और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs)) सीडी 8 के cytotoxicity को दबाने+ ट्यूमर microenvironment में टी कोशिकाओं, और है कि लक्ष्यीकरण इन विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं immunotherapies सुधार कर सकते हैं । यहां, हम एक इन विट्रो परख प्रणाली में मौजूद monocytic के प्रतिरक्षा दमन प्रभाव का मूल्यांकन-MDSCs और ट्यूमर पर TAMs की हत्या की क्षमता सीडी 8+ टी कोशिकाओं । इस अंत करने के लिए, हम पहले विरोधी के साथ भोली प्लीहा सीडी 8+ टी कोशिकाओं CD3/CD28 उपस्थिति या दमन कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी को सक्रिय करने, और फिर सह-संस्कृति एक fluorogenic की उपस्थिति में लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के साथ पूर्व सक्रिय टी कोशिकाओं caspase-3 सब्सट्रेट. कैंसर की कोशिकाओं में सब्सट्रेट से प्रतिदीप्ति टी सेल प्रेरित ट्यूमर सेल apoptosis के एक संकेतक के रूप में वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया था. इस परख में, हम सफलतापूर्वक TAMs या MDSCs के साथ पूर्व संस्कृति द्वारा सीडी 8+ टी कोशिकाओं और इसके दमन द्वारा ट्यूमर सेल apoptosis की वृद्धि का पता लगा सकते हैं । इस कार्यात्मक परख सीडी 8+ विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा टी सेल दमन तंत्र की जांच और druggable लक्ष्य की पहचान करने के लिए यह उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के माध्यम से उबरने के लिए उपयोगी है ।
यह ज्ञात है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं ट्यूमर कोशिकाओं को समाप्त कर सकते हैं जब वे अपने पूर्ण cytotoxicity डालती. टी सेल रिसेप्टर (TCR) के सक्रियकरण के बाद, सीडी 8+ टी कोशिकाओं पैदा करना और साइटोटोक्सिक प्रभाव कोशिकाओं में अंतर. विस्तारित और सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं साइटोटोक्सिक granules, perforin और granzymes, कि लक्ष्य कोशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे हैं और इस तरह lytic-3 मध्यस्थता caspase1के रूप में विभिन्न apoptosis रास्ते आरंभ सहित स्रावित. सीडी 8+ टी कोशिकाओं को भी इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक के लिए रिसेप्टर्स के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं, पर रिसेप्टर्स सक्रिय द्वारा ट्यूमर कोशिका apoptosis प्रेरित कर सकते हैं-α (TNF-α), पहले apoptosis संकेत ligand (FasL), या TNF से संबंधित apoptosis-उत्प्रेरण ligand (ट्रेल). इसके अलावा, सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं इंटरफेरॉन स्रावित-γ (IFN-γ) कि ट्यूमर सेल प्रसार को दबाने और सीडी 8 रिसेप्टर1के विनियमन के माध्यम से FasL+ टी कोशिकाओं के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । सीडी 8+ टी ट्यूमर हत्या की क्षमता के लिए क्षमता को देखते हुए, कई रणनीतियों उनके cytotoxicity को बढ़ावा देने के लिए (जैसे, चौकी अवरोधकों, कैंसर टीकाकरण, और chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) एक्सप्रेस टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण) की स्थापना की गई है और2कैंसर के कुछ प्रकार पर महत्वपूर्ण उपचारात्मक प्रभाव दिखाया । हालांकि, सबूत जमा पता चलता है कि ट्यूमर-ऐसी नियामक टी कोशिकाओं, माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (MDSCs), और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ सीडी 8+ टी सेल कार्यों को दबा सकते है और प्रभावकारिता को प्रतिबंधित की immunotherapies3,4,5. ऐसे immunotherapies को सुधारने के लिए यह समझना जरूरी है कि प्रतिरक्षा दमन कोशिकाओं की सीमा सीडी 8+ टी कोशिका cytotoxicity कैसे होती है. सीडी 8 की पहचान+ टी सेल दमन तंत्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से druggable लक्ष्य इसे दूर करने के लिए, के विकास और उपयोग में इन विट्रो परख की आवश्यकता होगी ।
सीडी 8+ टी सेल cytotoxicity को मापने के सोने के मानक विधि क्रोमियम रिलीज परख जिसमें रेडियोधर्मी जांच (५१Cr), लक्ष्य कोशिकाओं है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा लीजड ड है से जारी है,6निर्धारित है । हालांकि, इस परख अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता, उच्च पृष्ठभूमि सहित कई कमियां है, जल्दी अपोप्तोटिक घटनाओं, खतरनाक निपटान की समस्याओं का पता लगाने में असमर्थता, और स्वचालित तरल हैंडलिंग के साथ और सीमित संगतता का पता लगाने के लिए समर्थन उच्च प्रवाह अनुप्रयोगों । एक अंय आम विधि प्रवाह cytometric विश्लेषण जिसमें लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के apoptosis annexin V बाध्यकारी7द्वारा पता चला है । इस परख में, यह लक्ष्य सेल मौत propidium आयोडाइड (PI) या 7-aminoactinomycin डी (7-AAD) और प्रभाव सेल सक्रियकरण CD107a या CD69 अभिव्यक्ति, लक्ष्य कोशिकाओं में apoptosis के अलावा द्वारा संकेत का उपयोग कर के रूप में अंय मानकों का पता लगाने के लिए संभव है7 . हालांकि, इस परख क्रोमियम जारी परख की तुलना में दमन कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है । यह भी अनुयाई लक्ष्य कोशिकाओं की टुकड़ी और विसमुच्चय की आवश्यकता है और यह परिणाम पूर्वाग्रह कर सकते हैं । दरअसल, क्रोमियम जारी परख या प्रवाह cytometric परख सामांयतः टी सेल कार्यों पर दमन सेल प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । इसके बजाय, टी सेल प्रसार की माप एक फ्लोरोसेंट डाई के कमजोर पड़ने से संकेत (जैसे, CFSE) पूर्व टी कोशिकाओं में लोड अक्सर दमन कोशिकाओं द्वारा सीडी 8+ टी कोशिका समारोह के निषेध का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कल्चरल टी कोशिकाओं से IFN-γ उत्पादन का पता लगाना एक अन्य मानक विधि टी सेल सक्रियकरण8,9पर दमन कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है । हालांकि, इन परख से परिणाम जरूरी लक्ष्य सेल सीडी 8+ टी कोशिकाओं की हत्या की क्षमता को सहसंबंधी नहीं है ।
हम यहां मौजूद एक वैकल्पिक कार्यात्मक परख दमन कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विशेष रूप से मेटास्टेटिक ट्यूमर में मैक्रोफेज, सीडी 8 के cytotoxicity पर+ टी कोशिकाओं । इस विधि सीडी 8+ टी कोशिकाओं के cytotoxicity निर्धारित करता है, के साथ या विरोधी CD3/CD28 की उपस्थिति में शमन करनेवाला कोशिकाओं के बिना पूर्व संस्कृति, ट्यूमर कोशिका apoptosis का पता लगाने के द्वारा, एक प्रतिदीप्ति fluorogenic से caspase द्वारा संकेत-3 सब्सट्रेट6 स्वचालित समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल अंय तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं; यह केवल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है, उच्च संवेदनशीलता के साथ अनुयाई ट्यूमर कोशिका मृत्यु का पता लगाने में सक्षम बनाता है, छवि वास्तविक समय प्रभाव के लिए लक्ष्य बातचीत कर सकते हैं और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है.
इस प्रोटोकॉल में, मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAMs) और उनके जनक monocytic-MDSCs (एम-MDSCs) चूहों में मेटास्टेटिक ट्यूमर से अलग किया जाता है दमन कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । मेटास्टेटिक स्तन कैंसर के माउस मॉडल में, F4 के रूप में विशेषता मैक्रोफेज की एक अलग आबादी/80उच्चLy6G–CD11bउच्चLy6C मेटास्टेटिक ट्यूमर युक्त फेफड़ों मेंकम जमा । इस मैक्रोफेज जनसंख्या अक्सर सामांय फेफड़ों में पाया जाता है और इस तरह मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAMs)10कहा जाता है । इन माउस मॉडल में, एक और माइलॉयड कोशिका आबादी, F4 के रूप में परिभाषित/80उच्चLy6G–CD11b उच्च Ly6C उच्च, भी मेटास्टेटिक फेफड़ों में मुख्य रूप से जमा जहां यह MAMs11को जन्म देता है । उनकी विशेषताओं के आधार पर, CD11bउच्चLy6Cउच्च MAM जनक कोशिकाओं एम-MDSCs12का प्रतिनिधित्व हो सकता है ।
इस विधि दो अलग सह संस्कृति कदम पर आधारित है: सह संवर्धन सीडी 8+ संभावित शमन कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं, और सह संवर्धन लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ‘ पूर्व वातानुकूलित ‘ सीडी 8+ टी कोशिकाओं (चित्रा 1) । पहले सह संस्कृति कदम काफी सीडी 8+ टी सेल प्रसार परख सामांयतः सीडी 8+ टी सेल समारोह पर दमन कोशिकाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल के लिए इसी तरह की है । हालांकि, टी सेल प्रसार हमेशा उनके cytotoxicity के साथ सहसंबंधी नहीं है । उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि एम-MDSCs या MAMs के साथ सह-संस्कृति CD3/CD28 सक्रिय एंटीबॉडी (अनुपूरक आंकड़ा 3) की उपस्थिति में सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कम प्रसार के बजाय वृद्धि हुई है, जबकि इन पूर्व वातानुकूलित सीडी 8+ टी कोशिकाओं लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6) के खिलाफ कम cytotoxicity का प्रदर्शन किया । इन परिणामों कार्यात्मक गतिविधि के मूल्यांकन के महत्व पर प्रकाश डाला, लक्ष्य कैंसर सेल apoptosis द्वारा सबूत, इस सीडी 8+ टी सेल cytotoxicity परख द्वारा की पेशकश की ।
इस परख में, हम की पहचान की है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं की आवश्यकता लगभग 15 एच के सह संस्कृति के क्रम में E0771 के अधिकतम apoptosis-एलजी माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 5) प्रेरित करने के लिए । इस देरी लक्ष्य के साथ और प्रतिरक्षा synapse गठन के साथ प्रभाव कोशिकाओं के प्रारंभिक संपर्क के बीच अंतराल के कारण हो सकता है, साथ ही लक्ष्य में अपोप्तोटिक संकेतों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय के रूप में caspase-3 के सक्रियण द्वारा मापा (अनुपूरक फिल्म 1 ). हम यह भी पहचान लिया है कि अपोप्तोटिक ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या में 24 घंटे के बाद एक पठार तक पहुंच है, जो शायद टी कोशिकाओं और/या मृत कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान के उंमूलन के कारण है । इस क्षमता पीक apoptosis के समय की पहचान करने के लिए एक इष्टतम समय बिंदु के निर्धारण के बाद से इस परख का एक बड़ा लाभ है विभिंन स्थितियों के बीच उचित तुलना के लिए महत्वपूर्ण है । हमारे मामले में उदाहरण के लिए, नियंत्रण सीडी 8+ टी कोशिकाओं और MDSC/MAM-शिक्षित सीडी 8+ टी कोशिकाओं के बीच cytotoxicity में अंतर बहुत बड़ा था 15-18 ज की तुलना में ७२ ज (चित्रा 5), और इस प्रकार एक समापन बिंदु प्रयोग एक ७२ एच मशीन अवधि का उपयोग भ्रामक परिणाम निकलेगा ।
इस विधि भी वास्तविक समय प्रभाव के दृश्य में सक्षम बनाता है-लक्ष्य सेल संपर्क है, जो सीडी 8 के सीमित cytotoxicity अंतर्निहित तंत्र में अधिक से अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा+ टी कोशिकाओं पूर्व दमन कोशिकाओं के साथ मशीन । उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं पूर्व एम के साथ-MDSCs या MAMs सामना करना पड़ा और लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत की लेकिन हमेशा apoptosis (अनुपूरक फिल्म 4, अनुपूरक फिल्म 5, अनुपूरक फिल्म 6) प्रेरित नहीं किया । यद्यपि हम इस घटना नहीं है, यह संभव हो सकता है और दिलचस्प है और यों तो मुठभेड़ों के अनुपात और apoptosis प्रेरण के साथ संबंध में उनके संपर्क समय की तुलना होगा । एक और प्रमुख लाभ यह है कि इस विधि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, 1 x 10 लक्ष्य के3 और 4 x 10 ठीक प्रति प्रभाव कोशिकाओं के3 ) । वास्तव में, इस प्रोटोकॉल ३८४-अच्छी तरह प्लेट प्रारूप के लिए आगे लघुकृत अगर वांछित हो सकता है । इसलिए, इस परख उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग और प्रयोगों के लिए उपयुक्त है जहां सेल नंबर ऐसे इन विट्रो में vivo या पूर्व vivo नमूनों से व्युत्पंन कीमती कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण के रूप में सीमित हैं ।
दूसरी ओर, वर्तमान परख की सीमा कुछ स्थितियों में मृत प्रभाव कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या की उपस्थिति है । आदेश में है कि प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं से लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के भेद apoptosis में सटीकता को बढ़ाने के लिए, लक्ष्य कोशिकाओं के नाभिक लेबल और एक नाभिक आकार प्रतिबंध (जो प्रभाव कोशिकाओं को छोड़ता है) इस में डेटा विश्लेषण के लिए लागू किया जाता है परख (चित्रा 2) । हालांकि, कुछ उदाहरण है जहां के समुच्चय के ओवरले (green) अपोप्तोटिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं पर गैर-अपोप्तोटिक लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं है, जो परिणाम मिल सकता है । यह सीमा प्रभाव कोशिकाओं पर एक मृत कोशिका हटाने स्तंभ के उपयोग से कम किया जा सकता है, लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति से पहले, प्रभाव कोशिकाओं के पर्याप्त संख्या संभालने उपलब्ध हैं । अधिक जटिल माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के साथ, यह भी प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ एक fluorophore लक्ष्य सेल नाभिक और fluorogenic caspase-3 सब्सट्रेट से अलग लेबलिंग द्वारा झूठी सकारात्मक संकेत को कम करने के लिए संभव हो सकता है.
अब तक, इस प्रोटोकॉल सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रतिजन गैर विशिष्ट सक्रियण की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि MDSCs और TAMs ट्यूमर microenvironment में प्रतिजन गैर विशिष्ट तंत्र के माध्यम से टी सेल फ़ंक्शन को रोकें, परिधीय लसीकावत् ऊतकों में MDSCs एक प्रतिजन विशिष्ट तरीके से18टी सेल प्रतिक्रियाओं को रोकें । इस तरह के सेल प्रकार के प्रतिरक्षा शमन कार्यों की जांच करने के लिए, एक इन विट्रो प्रसार परख सीडी 8 का उपयोग+ OT से टी कोशिकाओं-1 ट्रांसजेनिक चूहों आमतौर पर प्रयोग किया जाता है । इस परख में, OT-1 टी कोशिकाओं (व्यक्त ovalbumin (ओवा) विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर) का सह-कल्चरल हैं, जो हमारे cytotoxicity परख (यानी, में टी कोशिकाओं के सक्रियकरण के लिए पहली संस्कृति के लिए लागू है, ओवा पेप्टाइड्स की उपस्थिति में दमन MDSCs के साथ उपस्थिति या दमन की अनुपस्थिति) । यह भी लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए संभव है ओवा व्यक्त करने के लिए, जो प्रतिजन-विशिष्ट कैंसर कक्ष OT-1 टी कोशिकाओं द्वारा हत्या पैदा कर सकते हैं । इसलिए, परख antigen-विशिष्ट T कक्ष सक्रियण के MAM/MDSC-मध्यस्थ दमन की जांच भी सक्षम करेगा । यह भी मानव कोशिकाओं की जांच करने के लिए परख लागू करने के लिए संभव है, के रूप में मानव CD3 और CD28 के खिलाफ सक्रियकरण एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और एक प्रोटोकॉल नैदानिक नमूनों से मानव TAMs को अलग करने के लिए स्थापित किया गया है19.
सामूहिक रूप से, यह परख काफी बहुमुखी है और अंय प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के cytotoxicity की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, हमारी प्रयोगशालाओं में, यह विभिन्न स्थितियों के तहत antigen-निर्भर सेल cytotoxicity की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा रहा है और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए भी विकसित किया जा रहा है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को वेलकम ट्रस्ट (101067/z/13/z (JWP) से अनुदान द्वारा समर्थित था, 109657/z/15/z (tk), 615KIT/J22738 (tk), यूके), और MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), यूके) । एनओसी और DDS राष्ट्रीय Phenotypic स्क्रीनिंग सेंटर Phenomics डिस्कवरी पहल और कैंसर रिसर्च यूके (एनओसी) से समर्थन स्वीकार
0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
DAPI | Biolegend | 422801 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |