Vi beskriver her en protokol for at undersøge cytotoksicitet af pre-aktiveret CD8+ T celler mod kræftceller ved at afsløre apoptotiske kræft celler via real-time mikroskopi. Denne protokol kan undersøge mekanismerne bag myeloide celler-induceret T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser sigter efterfyldning T celler via blokade af immun suppressiv myeloide celler.
Potensering af tumor-drab evne til CD8+ T celler i tumorer, sammen med deres effektive tumor infiltration, er et centralt element i vellykket immunoterapi. Flere undersøgelser har vist, at tumor infiltrerer myeloide celler (fx myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) og tumor-associerede makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksicitet af CD8+ T-celler i tumor mikromiljø, og at målrette disse lovgivningsmæssige myeloide celler kan forbedre immunoterapi. Vi præsenterer her, en in vitro assay system for at vurdere immun suppressiv virkninger af monocytic-MDSCs og TAMs på tumor-drab evne til CD8+ T celler. Til dette formål, vi først kulturperler naive milt CD8+ T-celler med anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer i tilstedeværelse eller fravær af suppressor celler, og derefter Co kulturperler pre-aktiveret T celler med målrette kræftceller i tilstedeværelse af en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra substrat i kræftceller blev opdaget af real-time Fluorescens mikroskopi som en indikator for T-celle induceret tumor celle apoptose. I denne analyse, kan vi med succes afsløre stigning af tumor celle apoptose af CD8+ T celler og dets undertrykkelse af pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funktionelle analyse er nyttige for efterforskningen CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer af regulerende myeloide celler og identificerer druggable mål at overvinde det via high throughput screening.
Det er kendt at CD8+ T celler kan fjerne tumorceller, når de udøver deres fulde cytotoksicitet. Efter aktivering af T-celle receptoren (TCR), CD8+ T celler formere sig og differentiere sig til cytotoksiske effektor celler. Den udvidede og aktiverede CD8+ T celler udskiller cytotoksiske granulat, herunder perforin og granzymes, der overføres til target-cellerne og indlede forskellige lytisk veje såsom caspase-3 medieret apoptose1. CD8+ T celler kan også inducere tumor celle apoptose ved aktivering receptorer på target-cellerne, såsom receptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterede apoptose-inducerende ligand (spor). Desuden aktiveres CD8+ T celler udskiller interferon-γ (IFN-γ), der kan undertrykke tumor celleproliferation og øge følsomheden af tumorceller til CD8+ T-celler via op-regulering af FasL receptor1. I lyset af potentialet for CD8+ T tumor drab evne, flere strategier til at øge deres cytotoksicitet (f.eks. checkpoint hæmmere, kræft vaccination og adoptiv overførsel af kimære antigen receptor (bil) udtrykker T-celler) er blevet etableret og vist betydelige terapeutiske virkninger på visse typer af kræft2. Dog, akkumulere beviser tyder på, at tumor infiltrerer immun celler som regulerende T-celler, myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs), og tumor-associerede makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8+ T celle funktioner og begrænse effekten immunoterapi3,4,5. For at forbedre sådanne immunoterapi, det er vigtigt at forstå, hvordan immun suppressor celler grænse CD8+ T-celle cytotoksicitet. Identifikation af CD8+ T-celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål at overvinde det, vil kræve udvikling og udnyttelse af in vitro-assays.
Guld standard metode til måling af CD8+ T-celle cytotoksicitet er chrom release analysen, hvor frigivelsen af den radioaktive sonde (51Cr), fra target celler der er mængden af CD8+ T-celler, er fast besluttet på6. Denne analyse har dog flere ulemper, herunder relativt lav følsomhed, høj baggrund, manglende evne til at opdage tidlige apoptotiske hændelser, farlige bortskaffelse problemer og begrænset kompatibilitet med automatiseret flydende håndtering og registrering for at støtte højere overførselshastighed applikationer. En anden fælles metode er flow cytometric analyser, hvor apoptose af mål tumorceller registreres af annexin V bindende7. I denne analyse er det muligt at opdage andre parametre såsom target celledød ved hjælp af propidium Iodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angivet ved CD107a eller CD69 udtryk, ud over apoptose i målcellerne7 . Denne analyse kræver imidlertid stort antal suppressor celler i forhold til chrom release assay. Det kræver også detachment og opdeling af vedhængende målcellerne og dette kan bias resultaterne. Faktisk, chrom frigive assay eller flow cytometric analyse ikke er almindeligt anvendt til at undersøge suppressor celle effekter på T-cellefunktioner. I stedet, måling af T-celle spredning angivet ved fortynding af et fluorescerende farvestof (f.eks. CFSE) pre-loaded ind i T-celler er ofte bruges til at evaluere hæmning af CD8+ T-cellefunktion af suppressor celler. Påvisning af IFN-γ produktion fra kulturperler T celler er en anden standard metode til at vurdere virkningerne af suppressor celler på T-celle aktivering8,9. Men resultaterne fra disse assays ikke nødvendigvis korrelerer til målcellen drab evne af CD8+ T celler.
Vi præsenterer her en alternativ funktionel analyse for at evaluere virkningerne af suppressor celler, især makrofager i metastatisk tumorer, på cytotoksicitet af CD8+ T celler. Denne metode bestemmer cytotoksicitet af CD8+ T celler, pre kulturperler med eller uden suppressor celler i overværelse af anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer, ved at opdage tumor celle apoptose, anført af fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat6 ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokol har flere fordele sammenlignet med andre metoder; Det kræver kun et lille antal celler, giver mulighed for påvisning af vedhængende tumor celledød med høj følsomhed, kan billedet real-time effektor-til-målet interaktion og er modtagelig for high throughput screening.
I denne protokol bruges metastase-associerede makrofager (MAMs) og deres stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isoleret fra metastatisk tumorer i mus som suppressor celler. I musemodeller af metastatisk brystkræft, en særskilt population af makrofager karakteriseret som F4/80højeLy6G–CD11bhøjLy6Clav ophobes i lungerne som indeholder metastatisk tumorer. Denne makrofag befolkning er sjældent fundet i den normale lunge og dermed kaldes metastase-associerede makrofager (MAMs)10. I disse musemodeller, en anden myeloide celler befolkning, defineret som F4/80højeLy6G–CD11bhøjLy6Chøj, også ophobes overvejende i metastatisk lunge hvor det giver anledning til MAMs11. Baseret på deres egenskaber, kan CD11bhøjLy6Chøj MAM stamfader celler repræsentere M-MDSCs12.
Denne metode er baseret på to separate Co kultur trin: Co dyrkning CD8+ T celler med potentielle suppressor celler, og co dyrkning ‘konditionerede’ CD8+ T celler med mål tumorceller (figur 1). Det første skridt i fælles kultur er meget lig at for CD8+ T celle spredning assays almindeligt anvendt til at bestemme virkningen af suppressor celler på CD8+ T-cellefunktion. Men T celleproliferation, ikke altid er korrelerer med deres cytotoksicitet. For eksempel, har vi fundet at co kultur med M-MDSCs eller MAMs steg i stedet for reduceret spredning af CD8+ T-celler i overværelse af CD3/CD28 aktivering antistoffer (supplerende figur 3), boer disse præ aircondition CD8+ T-celler viste reduceret cytotoksicitet mod målrette kræftceller (figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultater fremhæve betydningen af evalueringen af funktionelle aktivitet, fremgår af target kræft celle apoptose, der tilbydes af denne CD8+ T-celle cytotoksicitet assay.
I denne analyse har vi identificeret at CD8+ T celler kræver ca 15 h af fælles kultur for at fremkalde maksimal apoptose af E0771-LG mus brystkirtler tumorceller (figur 5). Denne forsinkelse kan skyldes forsinkelse mellem første kontakt af effektor celler med mål samt ledsagende immun synapse dannelse og tidsforbruget til at inducere apoptotisk signaler i mål som målt ved aktivering af caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identificeret som antallet af apoptotiske tumorceller nået et plateau efter 24 h, som er sandsynligvis på grund af afskaffelsen af mål af T-celler og/eller tab af fluorescerende signal fra døde celler. Denne evne til at identificere tidspunktet for peak apoptose er en væsentlig fordel ved denne analyse, da fastsættelse af et optimalt tidspunkt er vigtigt for passende sammenligninger mellem forskellige betingelser. I vores tilfælde f.eks forskellen i cytotoksicitet mellem kontrol CD8+ T celler og MDSC/MAM-uddannet CD8+ T celler var meget større på 15-18 h i forhold til 72 h (figur 5), og dermed et slutpunkt eksperiment ved hjælp af en 72 h inkubationstiden ville give misvisende resultater.
Denne metode giver også mulighed for visualisering af real-time effektor til målcellen interaktion, som ville give større indsigt i den mekanisme, der ligger til grund for begrænset cytotoksicitet af CD8+ T celler pre inkuberes med suppressor celler. For eksempel, vi bemærkede, at CD8+ T celler pre inkuberes med M-MDSCs eller MAMs stødt og kommunikerede med mål tumorceller men ikke altid inducerer apoptose (supplerende film 4, supplerende film 5, supplerende film 6). Selvom vi ikke sætte tal på denne begivenhed, vil det være muligt og interessant at måle og sammenligne andelen af møder og deres interaktion tid i sammenhæng med apoptose induktion. En anden stor fordel er, at denne metode kræver et lille antal celler (f.eks., 1 x 103 mål) og effektor celler pr. brønd 4 x 10,3 . I virkeligheden, kan denne protokol være yderligere miniaturized til 384-godt plade-format, hvis det ønskes. Denne analyse er derfor velegnet til high throughput screening og eksperimenter hvor celle tal er begrænset, såsom in vitro- test ved hjælp af precious celler stammer fra in vivo eller ex vivo prøver.
På den anden side er en begrænsning af den nuværende assay tilstedeværelsen af betydelige antal døde effektor celler i nogle betingelser. For at øge nøjagtigheden i skelne apoptose af målrette kræftceller fra af effektor CD8+ T celler, kerner af target celler er mærket og en kerner størrelse begrænsning (der udelukker effektor celler) anvendes til dataanalyse i dette assay (figur 2). Der er dog visse tilfælde hvor overlejring af aggregater af (grøn) apoptotiske CD8+ T celler på ikke-apoptotiske målrette kræftceller, som kan forvirre resultaterne. Denne begrænsning kan afbødes ved hjælp af en død celle fjernelse kolonne på effektor celler før Co kultur med mål tumorceller, under forudsætning af tilstrækkelig antal effektorceller celler er tilgængelige. Med mere komplekse mikroskopi systemer, kan det også være muligt at reducere de falsk positive signal ved mærkning effektor CD8+ T celler med en fluorophore adskilt fra target cellekerner og fluorogenic caspase-3 substrat.
Hidtil har denne protokol er blevet udnyttet til at undersøge antigen non-specifik aktivering af CD8+ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i tumor mikromiljø undertrykke T-cellefunktioner gennem antigen uspecifikke mekanismer, undertrykke MDSCs i de perifere lymfevæv T-celle respons i en antigen specifikke måde18. For at undersøge immun suppressiv funktioner af disse celletyper, en in vitro-spredning analyse ved hjælp af CD8+ T celler fra OT-1 Transgene mus er almindeligt anvendt. I denne analyse, OT-1 T-celler (udtrykker ægalbumin (æg) specifikke T-celle receptoren) er co kulturperler med suppressor MDSCs i nærværelse af æg peptider, som er gældende for den første kultur i vores cytotoksicitet assay (dvs.., aktiveringen af T-celler i tilstedeværelse eller fravær af undertrykkerne). Det er også muligt at manipulere målrette kræftceller til at udtrykke æg, som kan fremkalde antigen-specifikke kræft celle drab af OT-1 T-celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøgelse af MAM/MDSC-medieret undertrykkelse af antigen-specifikke T-celle aktivering. Det er også muligt at anvende analyse for at undersøge menneskelige celler, som aktivering antistoffer mod CD3 og CD28 er kommercielt tilgængelige, og en protokol til at isolere menneskelige TAMs fra kliniske prøver er blevet etableret19.
Kollektivt, denne analyse er meget alsidig og kan bruges til at undersøge cytotoksicitet af andre immun celletyper. I øjeblikket, i vores laboratorier, det er også for at undersøge antigen-afhængige celle cytotoksicitet under forskellige forhold og er også ved at blive udviklet for høj overførselshastighed screening.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra the Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) og MRC (hr./N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC og DDS anerkender støtte fra nationale fænotypiske Screening centrum Phenomics Discovery initiativ og Cancer Research UK (NOC)
0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
DAPI | Biolegend | 422801 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |