Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler
Summary
Denna artikel visar en kraftfull metod för att kvantifiera mitokondrier eller lysosomer i levande celler. Kombinationen av Lysosomen – eller mitokondrierna-specifika färgämnen med fluorescently konjugerade antikroppar mot ytmarkörer tillåter kvantifiering av dessa organeller i blandad cellpopulationer, som primära celler skördas från vävnadsprover, med hjälp av multicolor flödescytometri.
Abstract
T-celler använder olika metaboliska program för att matcha deras funktionella behov under differentiering och spridning. Mitokondrierna är viktiga cellulära komponenter ansvarar för att leverera cellen energi. dock producerar överflödig mitokondrier även reaktiva syreradikaler (ROS) som kan orsaka celldöd. Därför måste antalet mitokondrier ständigt justeras för att passa behoven hos cellerna. Denna dynamiska förordning uppnås delvis genom funktionen i lysosomer som tar bort överskott/skadade organeller och makromolekyler. Därför är cellulära mitokondrie och lysosomala innehållet viktiga indikatorer för att utvärdera den metabola justeringen av celler. Med utvecklingen av sonder för organeller, har välkarakteriserad Lysosomen eller mitokondrierna-specifika färgämnen blivit tillgängliga i olika format att märka cellulära lysosomer och mitokondrier. Multicolor flödescytometri är ett vanligt verktyg till profil cell fenotyper och har förmågan att integreras med andra analyser. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för hur man kombinerar organell-specifika färgämnen med yta markörer färgning för att mäta mängden lysosomer och mitokondrier i olika T-cells populationer på en flödescytometer.
Introduction
Aktivering och spridning av T-celler är kritiska moment för montering av framgångsrika immunsvar. Senaste framstegen föreslår att cellulära metabolismen är tätt förknippad med både utveckling och funktioner av T-celler. Till exempel beroende naiva T-celler till stor del oxidativ fosforylering (OXPHOS) för att möta energibehovet under recirkulation bland sekundära lymfoida organ. Vid aktivering genomgår naiva T-celler drastiska metabola omprogrammering, inklusive induktion av aerob glykolys att öka ATP produktionen och för att uppfylla de enorma metabola krav under celldifferentiering och spridning. De celler som misslyckas med att följa via metabola behov dör av apoptos1,2. Under metabola omprogrammering, spelar mitokondrierna en viktig roll eftersom de är till stor del ansvarig för produktionen av ATP att leverera energi för cellens organeller och cellulär mitokondrier innehållet varierar under metabola växlar hela T cell utveckling och aktivering3. Dock kan ansamling av överflödiga eller skadade mitokondrier producera överskott ROS som skada lipider, proteiner och DNA, och kan så småningom leda till cell död4
Överdriven eller skadade mitokondrierna följd av metabola förändringar tas bort av en specialiserad form av autofagi5, känd som mitophagy. Mitokondrierna är insvept av autophagosomes och sedan smält med lysosomer för nedbrytning. Dessa nära kommunikation mellan mitokondrier och lysosomer har genererat stort intresse6,7. Till exempel oxidativ stress stimulerar mitokondrierna bildar mitokondrier-derived blåsor (MDVs) som är riktade till lysosomer för nedbrytning i ett fosfatas och Tenzin homolog (PT)-inducerad förmodad kinase 1 (PINK1) och parkin (en E3 ubiquitin ligase) koncentrationsberoende sätt8. Det konstaterades också att mitophagy är viktigt för beige till vita fettceller övergången9,10. Lysosomer är viktigare, inte bara en nedbrytning kupé, men också en regulator av cellulär signalering. Överdriven substrat ackumulering på grund av enzymbrist resulterar i lysosomala dysfunktion genom att störa lysosomala membranet permeabilitet och påverkar Ca2 + homeostas f11. T-cell funktionella brister i lysosomalt surt lipas (LAL)12 eller lysosomala metabolit transportör knockout mus modell13 visade ytterligare vikten av lysosomer att upprätthålla T cell homeostas. Både mitokondrier och lysosomer är oskiljaktiga delar av cellulära metaboliska förordning. Mätning av cellulära mitokondriell innehåll har därför varit en viktig indikator för att utvärdera T cells metaboliska och funktionella status.
Analyser som vanligen används för att kvantifiera cellulära mitokondrie eller lysosomala innehållet inkluderar immunoblot, elektronmikroskopi, Immunofluorescerande (om) färgning och PCR-analys av mitokondrie DNA kopia nummer14,15, 16. medan immunoblot kan kvantitativt jämföra proteinnivåer mellan olika prover och electron eller om mikroskopi kan visualisera morfologiska kännetecken för dessa organeller17, dessa analyser bära vissa tekniska nackdelar. Exempelvis är det tidskrävande att förvärva tillräckligt antal cell bilder med hög förstoring och upplösning eller att jämföra de uttrycksnivåerna av ett protein i dussintals prover, att göra dessa analyser anses vara låg genomströmning metoder. Dessutom kan dessa analyser endast tillämpas till homogen cell befolkningen, såsom cellinjer, men inte till vävnadsprover som består av blandade populationer.
Det är också svårt att tillämpa dessa analyser på sällsynta populationer, som kravet på minimal cell nummer från 106 108 är omöjligt att uppfylla. Slutligen, celler vanligtvis lyserat eller fast under processen, vilket gör dem oförenligt med andra metoder för att extrahera ytterligare information. Jämfört med de traditionella metoderna, fluorescerande-baserade flödescytometri har en relativt hög genomströmning – informationen för alla cellerna i ett prov består av blandad cellpopulationer kan analyseras och samlas in samtidigt. Dessutom kan upptäcka mer än 10 parametrar på samma cell och sortera celler baserat på önskad fenotyper för vidare analyser. Reaktiva fluorescerande sonder har använts för att märka lysosomer och mitokondrier i levande celler och kan upptäckas av flöde flödescytometri18,19. Dessa organell-specifika prober har cell genomsläpplig och fysikalisk-kemiska egenskaper som tillåter dem att vara koncentrerade till särskilda subcellulär platser eller organeller. Bekvämt, finns dessa sonder i olika fluorescerande format, vilket gör att deras ansökan om multicolor analys.
Det här protokollet beskriver i detalj hur man kombinerar ytan markör färgning med Lysosomen – eller mitokondrierna-specifika färgämnen till etikett lysosomer eller mitokondrier i levande celler. Detta är särskilt användbart för prover som genereras från primära vävnader och organ, vilka ofta består av heterogena cellpopulationer. Forskare kan identifiera cellpopulationer av intresse av sin yta markör uttryck och specifikt mäta lysosomala eller mitokondrie innehållet genom organell-specifika färgämnen i dessa celler. Här visar vi detaljerade förfarandet för flöde flödescytometrisk analys som utvärderar lysosomala eller mitokondrie massan i stora mjälten T cell subpopulationsna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll kombinerar organell-specifika färgämnen och ytan markör färgning för att kvantifiera mängden mitokondrier eller lysosomer i olika T-cells populationer. Denna metod utvecklades för att övervinna begränsning av cell nummer och homogenitet krav för traditionella metoder, såsom elektronmikroskopi och immunoblot analys. Det är särskilt användbart i analysera ovanlig cellpopulationer och samtidigt undersöka flera celltyper samtidigt.
Varaktigheten av förfarandet och t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen av detta protokoll stöds av bidrag från den Taiwan ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta) NSC103-2320-B-010-002-MY2 och MOST104-2628-B-010-002-MY4 till C.L. Hsu. C.W. Wei är mottagare av utmärkta avhandling Award av Institutet för mikrobiologi och immunologi, National Yang-Ming University.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
