Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen
Summary
Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom – of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.
Abstract
T-cellen maken gebruik van verschillende metabole programma’s op maat van hun functionele behoeften tijdens de differentiatie en proliferatie. Mitochondriën zijn cruciale cellulaire componenten verantwoordelijk voor het verstrekken van de energie van de cel; overtollige mitochondriën produceren echter ook reactieve zuurstof soorten (ROS), die leiden celdood tot kan. Het aantal mitochondriën moet daarom voortdurend worden aangepast aan de noden van de cellen. Deze dynamische verordening wordt ten dele bereikt door de functie van lysosomen dat overschot/beschadigde organellen en macromoleculen verwijderen. Vandaar, cellulaire mitochondriale en lysosomale inhoud zijn belangrijke indicatoren voor de evaluatie van de metabole aanpassing van cellen. Met de ontwikkeling van sondes voor organellen, zijn goed gekarakteriseerd lysosoom of mitochondriën-specifieke kleurstoffen beschikbaar gekomen in verschillende formaten om te etiketteren cellulaire lysosomen- en mitochondriën. Multicolor stroom cytometry is een gemeenschappelijk instrument om profiel cel fenotypen, en heeft de mogelijkheid om te worden geïntegreerd met andere testen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het organel-specifieke kleurstoffen combineren met oppervlakte markeringen voor het meten van de hoeveelheid lysosomen- en mitochondriën in andere T-cel populaties op een stroom cytometer kleuring.
Introduction
De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en proliferatie. De cellen die niet te volgen via de metabolische behoeften sterven door apoptosis1,2. Tijdens de metabole herprogrammering, spelen mitochondria een belangrijke rol omdat zij de organellen grotendeels verantwoordelijk voor de productie van ATP om energie voor de cel, en de inhoud van de cellulaire mitochondriën tijdens metabole schakelaars schommelt in de gehele T cel ontwikkeling en activering3. Echter, de accumulatie van overtollige of beschadigde mitochondriën overtollige ROS die schade van DNA, lipiden en proteïnen, en kan uiteindelijk leiden tot de dood4 cel kan produceren
De mitochondriën van het overmatig of beschadigd ten gevolge van metabolische omzetting worden verwijderd door een gespecialiseerde vorm van autophagy5, bekend als mitophagy. Mitochondriën zijn verpakt door autophagosomes en vervolgens gesmolten met lysosomen voor afbraak. Dit sluit communicatie tussen mitochondriën en lysosomen hebben gegenereerd grote belangstelling6,7. Bijvoorbeeld, oxidatieve stress stimuleert mitochondriën om te vormen van de mitochondriën-derived vesicles (MDVs) die op lysosomen voor afbraak in een fosfatase en Tenzin homolog (PTEN gericht zijn)-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) en parkin (een E3 ubiquitin ligase) afhankelijke wijze8. Ook bleek dat mitophagy is essentieel voor beige-naar-wit adipocyte overgang9,10. Nog belangrijker, zijn lysosomen niet alleen een aantasting van het compartiment, maar ook een regulator van cellulaire signalering. Buitensporige substraat accumulatie te wijten aan de tekortkomingen van het enzym leidt tot een lysosomale dysfunctie door het verstoren van de lysosomale membraan permeabiliteit en Ca2 + homeostase11beïnvloedt. De T cel functionele defecten in lysosomale zure lipase (LAL)12 of lysosomale metaboliet vervoerder knockout muis model13 bleek verder het belang van lysosomen in het handhaven van de T cel homeostase. Mitochondriën zowel lysosomen zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden delen van cellulaire metabole verordening. Daarom is de meting van het cellulaire mitochondriale een cruciale indicator om te evalueren van de T cel metabole en functionele status geweest.
Gebruikte te kwantificeren van cellulaire mitochondriale of lysosomale inhoud testen omvatten immunoblot, elektronenmicroscopie immunefluorescentie (IF) kleuring en PCR analyse van mitochondriaal DNA kopie nummers14,15, 16. terwijl immunoblot kwantitatief eiwitniveaus over verschillende monsters en elektron of vergelijken kan als microscopie morfologische kenmerken van deze organellen17kunt visualiseren, deze gehaltebepalingen dragen bepaalde technische nadelen. Bijvoorbeeld, is het tijdrovend te verwerven van voldoende aantal cel beelden met hoge vergroting en resolutie of wilt vergelijken in de niveaus van de expressie van een proteïne over tientallen monsters, maken deze gehaltebepalingen beschouwd als lage doorvoersnelheid methoden. Deze testen kunnen bovendien alleen worden toegepast, tot homogene celpopulatie, zoals cellijnen, maar niet tot weefselsteekproeven dat bestaat uit een gemengde bevolking.
Het is ook moeilijk toe te passen deze gehaltebepalingen op zeldzame populaties, waarvoor de eis voor minimale cel nummers van 106 tot 108 onmogelijk is om te voldoen aan. Ten slotte, cellen zijn meestal lysed of vaste tijdens het proces, waardoor ze onverenigbaar zijn met andere methoden verder om informatie te extraheren. Vergeleken met de traditionele methoden, TL gebaseerde stroom cytometry heeft een relatief hoge doorvoersnelheid – de informatie van alle cellen binnen een steekproef samengesteld van gemengde cel bevolking kan worden geanalyseerd en gelijktijdig verzameld. Daarnaast kan detecteren meer dan 10 parameters op dezelfde cel en sorteren van de cellen op basis van gewenste fenotypen voor verdere testen. Reactieve fluorescerende sondes zijn gebruikt om het label lysosomen- en mitochondriën in levende cellen en kunnen worden gedetecteerd door stroom cytometry18,19. Deze organel-specifieke sondes zijn cel doorlaatbare en fysisch-chemische eigenschappen die de mogelijkheid moet worden geconcentreerd in de specifieke subcellular locaties of organellen. Deze sondes zijn gunstig, beschikbaar in verschillende TL formaten, zodat hun toepassing voor multicolor analyse.
Dit protocol beschrijft in detail hoe combineren oppervlakte marker kleuring met lysosoom – of mitochondriën-specifieke kleurstoffen aan label lysosomen of mitochondriën in levende cellen. Dit is vooral handig voor monsters die zijn gegenereerd op basis van primaire weefsels en organen, die vaak bestaan uit heterogene cel populaties. Onderzoekers kunnen identificeren cel populaties van belang door hun oppervlakte marker-expressie en specifiek meten de lysosomale of mitochondrial inhoud via organel-specifieke kleurstoffen in deze cellen. Hier tonen we de gedetailleerde procedure voor flow cytometrische analyse die wordt geëvalueerd als de lysosomale of mitochondrial massa in de grote milt T cel subpopulaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol combineert organel-specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker vlekken om te kwantificeren van het bedrag van de mitochondriën of lysosomen in andere T-cel populaties. Deze methode is ontwikkeld om te overwinnen de beperking van cel nummer en homogeniteit eisen voor traditionele methoden, zoals elektronenmicroscopie en immunoblot analyse. Het is vooral nuttig in zeldzame cel populaties te analyseren en gelijktijdig behandeling van meerdere celtypen tegelijk.
De duur van de proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door subsidies van de Taiwan ministerie van wetenschap en technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 en MOST104-2628-B-010-002-MY4 voor C.L. Hsu. C.W. Wei is een ontvanger van uitstekende Thesis Award Instituut van microbiologie en immunologie, National Yang-Ming University.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
