Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T
Summary
Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.
Abstract
Células T utilizam diferentes programas metabólicos para combinar com suas necessidades funcionais durante a proliferação e diferenciação. As mitocôndrias são componentes celulares cruciais responsáveis pelo fornecimento de energia da célula; no entanto, as mitocôndrias em excesso também produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem causar morte celular. Portanto, o número de mitocôndrias constantemente deve ser ajustado para atender às necessidades das células. Este regulamento dinâmico é alcançado em parte através da função de lisossomos que removem macromoléculas e organelas excedente/danificado. Portanto, o conteúdo mitocondrial e dos lisossomos celular é indicadores-chave para avaliar a adaptação metabólica das células. Com o desenvolvimento de sondas para organelas, bem caracterizada lisossoma ou corantes específicos de mitocôndrias tornaram-se disponíveis em vários formatos para rotular as mitocôndrias e lisossomos celulares. Citometria de fluxo multicolor é uma ferramenta comum de fenótipos de célula de perfil e tem a capacidade de ser integrado com outros ensaios. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como combinar os corantes específicos organela com marcadores de superfície coloração para medir a quantidade de lisossomos e mitocôndrias em populações diferentes de células T em um citômetro de fluxo.
Introduction
A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células que não conseguem cumprir as necessidades metabólicas morrem por apoptose1,2. Durante a reprogramação metabólica, mitocôndrias desempenham papéis importantes, uma vez que eles são as organelas em grande parte responsáveis pela produção de ATP para fornecer energia para a célula, e o conteúdo de mitocôndrias celulares flutua durante switches metabólicas em toda a célula T desenvolvimento e ativação3. No entanto, o acúmulo de mitocôndrias supérfluos ou danificadas pode produzir excesso ROS que danificam lipídeos, proteínas e DNA e pode eventualmente levar a célula a morte4
As mitocôndrias excessivas ou danos resultantes de alterações metabólicas são removidas por uma forma especializada de autofagia5, conhecido como mitophagy. Mitocôndrias são delimitadas por autophagosomes e então fundidas com lisossomos para degradação. Estas fechem as comunicações entre mitocôndrias e lisossomos têm gerado grande interesse6,7. Por exemplo, o estresse oxidativo estimula mitocôndrias para formar vesículas mitocôndrias-derivado (MDVs) que são alvo de lisossomos para degradação em um homólogo fosfatase e tensin (PTEN)-induzido putativa quinase 1 (PINK1) e Pereira Barbosa (um E3 ubiquitina ligase) dependente da forma8. Verificou-se também que mitophagy é essencial para a transição de adipócito branco bege-para9,10. Mais importante, lisossomos não são meramente um compartimento de degradação, mas também um regulador de sinalização celular. Acumulação excessiva de substrato devido a deficiência enzimática resulta em disfunção dos lisossomos por perturbar a permeabilidade da membrana dos lisossomos e afeta Ca2 + homeostase11. Os defeitos funcionais de células T em lipase ácida lisossômica (LAL)12 ou metabólito lisossomal transportador nocaute do mouse modelo13 revelou ainda a importância de lisossomos na manutenção da homeostase de células T. Tanto as mitocôndrias e lisossomos são partes inseparáveis da regulação metabólica celular. Portanto, a medição de conteúdo mitocondrial celular tem sido um indicador fundamental para avaliar o status de metabólica e funcional de células T.
Ensaios comumente usados para quantificar o conteúdo mitocondrial ou dos lisossomos celular incluem immunoblot, microscopia eletrônica, imunofluorescência (IF) coloração e análise PCR de mitochondrial DNA copiar números14,15, 16. enquanto immunoblot quantitativamente pode comparar níveis de proteína em diferentes amostras e elétron ou se microscopia pode visualizar as características morfológicas destas organelas17, estes ensaios suportar certas desvantagens técnicas. Por exemplo, é demorado para adquirir um número suficiente de imagens de células com alta ampliação e resolução ou para comparar os níveis de expressão de uma proteína em dezenas de amostras, tornando estes ensaios considerados métodos de baixa taxa de transferência. Além disso, estes ensaios só podem ser aplicados à população da pilha homogénea, tais como linhas de celular, mas não para amostras de tecido que são compostas de populações mistas.
Também é difícil de aplicar estes ensaios para populações raras, para as quais a exigência de mínima célula números de 106 108 é impossível de encontrar. Finalmente, as células são geralmente lysed ou fixo durante o processo, tornando-os incompatíveis com outros métodos para extrair mais informações. Comparado com os métodos tradicionais, citometria de fluxo fluorescente-based tem um relativamente alto throughput – as informações de todas as células dentro de uma amostra compostas de populações de células mistas podem ser analisadas e coletadas simultaneamente. Além disso, um pode detectar mais de 10 parâmetros na mesma célula e classificar as células com base em fenótipos desejados para mais ensaios. Sondas fluorescentes reativas tem sido usadas para rotular lisossomos e mitocôndrias em células vivas e podem ser detectadas por citometria de fluxo18,19. Estas sondas específicas das organelas são célula permeável e têm características físico-químicas que lhes permitam concentrar-se em locais específicos subcellular ou organelas. Convenientemente, estes testes estão disponíveis em vários formatos fluorescentes, permitindo assim a sua aplicação para análise multicolor.
Este protocolo descreve em detalhes como combinar o marcador de superfície a coloração com corantes lisossomo mitocôndria-específico ou de lisossomos rótulo ou as mitocôndrias em células vivem. Isso é especialmente útil para amostras geradas a partir de tecidos primários e órgãos, que muitas vezes são compostos de populações de células heterogêneas. Pesquisadores podem identificar populações de células de interesse pela sua expressão do marcador de superfície e medir especificamente o conteúdo dos lisossomos ou mitocondrial através de corantes específicos organela nestas células. Aqui, demonstramos o procedimento detalhado de análise de fluxo cytometric que avalia a massa dos lisossomos ou mitocondrial em subpopulações o major esplênica T cell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo combina corantes específicos organela e marcador de superfície coloração para quantificar a quantidade de mitocôndrias ou lisossomos em populações diferentes de células T. Este método foi desenvolvido para superar a limitação da cela número e homogeneidade requisitos para os métodos tradicionais, tais como a microscopia eletrônica e análise de immunoblot. É especialmente útil na análise de populações de células raras e examinando simultaneamente vários tipos de células ao mesmo tempo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado por concessões do Taiwan Ministério da ciência e tecnologia (a maioria) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 de C.L. Hsu. C.W. Wei é um receptor de excelente tese prêmio do Instituto de Microbiologia e Imunologia, Universidade Nacional de Yang-Ming.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
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