Isolasjon og kultur av embryonale mus embryonale stamceller
Summary
Her introduserer vi en Mikrokirurgiske teknikken for isolering av nevrale stamceller fra E13 musen fosteret ganglionic eminense.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) er multipotent og kan gi opphav til de tre store celle typene sentralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og utvidelse av NSCs gi en passende kilde celler for nevrologer å studere funksjon av nevroner og gliacellene sammen med deres samspill. Det finnes flere rapporterte teknikker for isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo pattedyr hjerner. Under Mikrokirurgiske operasjonen isolere NSCs fra forskjellige regioner i embryonale CNS, er det svært viktig å redusere skade på hjernen celler å få den høyeste forholdet mellom live og utvidbart stamceller. En mulig teknikk for stress reduksjon under isolasjon av disse cellene fra musen embryoet hjernen er reduksjonen av kirurgiske tid. Her viser vi en utviklet teknikk for rask isolering av disse cellene fra E13 musen fosteret ganglionic eminense. Kirurgiske prosedyrer inkluderer høsting E13 mouse embryoer fra livmoren, kutte den frontal fontanelle av embryoet med en bøyd pinne-spissen, utpakking hjernen i skallen, microdissection av isolerte hjernen å høste ganglionic eminense, dissosiasjon høstet vevet i NSC medium for å få en enkeltcelle suspensjon, og til slutt plating celler i suspensjon kultur for å generere neurospheres.
Introduction
Nevrale stamceller (NSCs) ligger i forskjellige områder av voksen og embryo hjernen og de har en tendens til å generere ulike typer nerveceller og glial celle1. Subventricular soner i voksen pattedyr hjernen2 og ganglionic anseelse i fosteret hjernen er NSC rike regioner3. I utvikle hjernen leverer ganglionic eminense de fleste kortikale interneurons og spesielt GABAergic interneurons3. Det er også mindre invasive metoder for nevrale stamceller generasjon fra embryonale stamceller (ESCs) eller indusert pluripotent stamceller (iPSCs) som reduserer behovet for dyr bruk. Til tross for at genererer NSCs fra ESCs eller iPSCs er mulig4,5, har den noen fordeler og ulemper sammenlignet med isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo hjernen6,7, 8. Protokollene for inducing differensiering av ESCs og iPSCs mot neuronal fenotyper er alltid tid og kostnader forbruker og frekvensen av suksess (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolering av NSCs fra dyr hjernen ( mer enn 99% Nestin positive celler)9. Videre miste stamceller deres genetisk stabilitet og differensiering tendens etter flere avsnitt10,11. Selv om det er andre nye rapporter om direkte konvertering av somatiske celler i NSCs, disse cellene er genmodifisert og er ikke lett tilgjengelig i hver lab12. Derfor er det fortsatt et stort behov for isolering av nevrale stamceller fra dyr hjernen; Det er mulig å redusere antall dyr behandling ved å forbedre kirurgiske teknikker. Reduserer kirurgiske og forbedre teknikkene, er det mulig å holde celler fra skade og få den høyeste frekvensen av NSCs fra hvert dyr.
Her introduserer vi en forenklet og reproduserbar teknikk for isolering av nevrale stamceller fra mus E13 embryoet hjerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruke en egnet kilde av nevrale stamceller er svært viktig for neuroscientists. Nevrale stamceller kan høstes fra ulike områder av embryoet hjernen og de kan generere bestemte typer nerveceller og gliacellene. Det finnes flere metoder for induksjon av nevrale stamceller å overtale dem til å generere modne nevroner og gliacellene. Det er mange rapporter indikerer at under bestemte kultur forhold og trophic faktor regimenter, de kunne generere neurons14, oligodendrocytes15</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Royan Institute.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
