Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.
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Articolo metodologico
Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici
In questo articolo
Sommario
Abstract
In vitro l'autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l'associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (Kd), costanti di inibizione (Kio) così come la densità di siti di legame (Bmax) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell'acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l'analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.
Introduzione
Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l'obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (Kd) e densità di siti di legame (Bmax), nonché per la determinazione la costan....
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Protocollo
Tutti gli animali gestione è stata eseguita in conformità con le linee guida da The ispettorato danese di sperimentazione animale.
Nota: Il protocollo descritto qui copre (cioè, tessuto di cervello di topo), preparazione di tessuti in vitro autoradiografico dosaggio in modo sufficientemente dettagliato per l'impostazione del metodo in un nuovo laboratorio, l'esposizione al fosforo piastre di imaging come pure successiva analisi densitometrica di autoradiogrammi (Figura 2) con lo scopo di localizzare e quantificare radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Per il confronto istologic....
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Risultati
Utilizzando il protocollo descritto, la distribuzione anatomica di siti di legame ad alta affinità GHB è stata visualizzata con l'analogo GHB radiomarcato [3H] HOCPCA nel cervello di topo, che è stato tagliato in sezioni coronale, sagittali e orizzontale (Figura 3 ). Alti livelli di associazione sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, inferiore nel corpo striato e l'associazione non è state rilevate nel cervelletto, corrispondenti ai.......
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Discussione
La qualità di un'analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)23e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di ligandi noti è e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione Lundbeck (Grant R133-A12270) e la Fondazione di Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Gli autori ringraziano il Dr. Aleš Marek per la fornitura di radioligand [3H].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Etanolo assoluto | Merck Millipore | 107017 | |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Piastra di imaging | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20x40 cm - Sensibile al trizio |
| Cresil violetto acetato | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (terreno di montaggio non acquoso per microscopia) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus vetrini | VWR | 631-9483 | vetrini per microscopio |
| Tissue-Tek Set di colorazione manuale dei vetrini | Sakura Finetek Danimarca ApS | 4451 | |
| Trizio Standard su vetro | Chimica radiomarcata americana, Inc. | ART 0123 | |
| Sostituto dello xilene | Sigma-Aldrich | A5597 |
Riferimenti
- Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
- Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
- Pavey,....
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Ristampe e permessi
