نقدم اختبار الفلورة لإثبات أن لوسيفر الأصفر (LY) هو علامة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلايا الظاهرة من الخلايا أحادية hCMEC /D3، وهو نموذج في المختبر من حاجز الدم والدماغ البشري. استخدمنا هذا الفحص لتحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات في خلايا hCMEC/D3 المستزرعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتكون حاجز الدم في الدماغ BBB من الخلايا البطانية التي تشكل حاجزا بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ لمنع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة. تقاطعات ضيقة (TJ) ختم فعال الفضاء شبه الخلوية في الطبقات الأحادية مما أدى إلى حاجز سليمة. تصف هذه الدراسة فحص الفلورة القائم على LY التي يمكن استخدامها لتحديدمعامل نفاذية واضحة (P التطبيق) وبدورها يمكن استخدامها لتحديد حركية تشكيل الطبقات الأحادية المطابقة وتقاطع ضيق الناتجة سلامة الحاجز في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. كما نبرهن على فائدة إضافية من هذا الاختبار لتحديد السلامة الوظيفية TJ في الخلايا المنقولة. بياناتنا من LY Pالتطبيق فحص يظهر أن الخلايا hCMEC / D3 البذر في إعداد transwell تحد بشكل فعال LY النقل شبه الخلوي 7 أيام بعد الثقافة. كفائدة إضافية من فحص المقدمة، ونحن نثبت أيضا أن نقل الجسيمات النانوية الحمض النووي لا يغير LY النقل شبه الخلوي في الطبقات الأحادية hCMEC/D3.
المقدمة
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو الحاجز الوقائي الذي يحد من تدفق مكونات البلازما إلى أنسجة الدماغ ويتكون من خلايا بطانة الدماغ جنبا إلى جنب مع الخلايا الداعمة مثل pericytes. الدور الرئيسي لBBB هو أن تكون بمثابة الحاجز الذي يختم المسافة بين الدم المحيطي والجهاز العصبي المركزي (CNS) للحفاظ على الهيموسات من البيئة الدقيقة العصبية1،2. الخلايا البطانية الشعرية في الدماغ ختم المسار شبه الخلوي بشكل فعال عن طريق تشكيل تقاطعات ضيقة بين الخلايا (TJs)1. هذا الحاجز الواقي يسمح الجلوكوز والمواد الغذائية المختارة لدخول الدماغ في حين أنه يمنع غالبية الأيونات والمواد السامة والأدوية من المرور من خلال هذا ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1.General hCMEC /D3 ثقافة الخلية
- إنعاش الخلايا المجمدة
ملاحظة: تم إجراء جميع صيانة ثقافة الخلايا والتجارب داخل غطاء أمان حيوي معقم. تم شراء وسائل الإعلام الثقافية والمكملات الغذائية والكواشف كمنتجات معقمة أو تعقيمها عن طريق الترشيح باستخدام فلتر غشاء 0.22 م لمنع التلوث الميكروبي.- إضافة 8.5 مل من محلول الكولاجين (0.15mg /mL) في قارورة زراعة الأنسجة (75 سم2 منطقة النمو؛ يشار إليها من الآن فصاعدا باسم T75) ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 1 ساعة.
- إزالة محلول الكولاجين وغسل بلطف قارورة مع معقم الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). أضف 15 مل من وسط النمو الكامل إلى القارورة واتركها في حاضنة CO....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أولا، حددنا تأثير وقت الزراعة على نفاذية LY لتحديد الحركية الظاهرة لتشكيل TJ. يتم عرض قيمالتطبيق LY P المتوسط من اليوم 1 إلى 10 آخر البذر في الشكل 2a. في اليوم 1، كانمتوسط P التطبيق 4.25 × 10-4 سم / دقيقة وانخفض قليلا إلى 3.32 × 10-4 سم / دقيقة في اليوم 2. متوسط قيمةالتطبيق P زيادة طفيفة إلى 3.93 × 10-4 سم / دقيقة في اليوم 3 وتقلبت مع عدم وجود تغييرات كبيرة حتى اليوم 6. انخفضت قيمالتطبيق
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دور رئيسي لBBB هو منع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ للحفاظ على انحلال البيئة الدقيقة العصبية. واحدة من السمات المميزة لBBB هو قدرة الخلايا البطانية الشعرية لتشكيل تقاطعات ضيقة (TJs) التي ختم على نحو فعال الطريق شبه الخلوي للنقل. أظهرنا فحصالتطبيق LY P كطريقة كمية لتحديد الحركية الظاهرة لتكوين حاجز TJ في الطبقات الأحادية hCMEC/D3 المستزرعة. تم الكشف عن تعبير ZO-1 عبر النشاف الغربي بشكل أقاصي للبيانات من دراساتتطبيق LY P كما تمت مناقشتهب بالتفصيل في الف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من جائزة المحقق الجديد لعام 2017 من الرابطة الأمريكية للصيدلية، وجائزة هوكلمني للأمراض المخيفة من جامعة دوكين، وأموال بدء كلية الصيدلة لمختبر مانيكام. نود أن نشكر مختبر تسرب (جامعة Duquesne) للمساعدة الغربية النشاف والسماح باستخدام الصور أوديسي 16 بت. ونود أيضا أن ندرج مذكرة تقدير خاصة لكاندارب ديف (مختبر مانيكام) للمساعدة في النشاف الغربية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| hCMEC / D3 خط الخلية | مختبرات Cedarlane | 102114.3C-P25 | خط الخلايا البطانية الدماغية الدقيقة للوعائية الدقيقة البشرية ؛ |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | الحمض النووي البلازميد يشفر جين لوسيفيراز |
| الأصفر CH ملح ثنائي الليثيوم | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell مع أغشية محفورة بالبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) Falcon | 353095 | ||
| قارورة ثقافة الأنسجة | أوليمبوس بلاستيك | 25-207 | |
| 24 بئر مسطحة القاع | أوليمبوس بلاستيك | 25-107 | |
| لوحات مناعية سوداء 96 بئر | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | الوسط الأساسي الدوار الأدنى (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | الخلية البطانية القاعدية المتوسطة -2 (EBM-2) |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X | HyClone | SH3025601 | |
| الكولاجين من النوع الأول & nbsp ؛ | ديسكفري لابوير ، إنك. | 354236 | |
| مجموعة فحص البروتين Pierce BCA | Thermo Scientific | 23227 | |
| تحلل ثقافة الخلية 5X كاشف | Promega | E1531 | |
| خنفساء لوسيفيرين ، ملح البوتاسيوم | بروميجا | E1601 | |
| سبيكتراماكس i3 | الجزيئية | قارئ لوحة مضان | |
| محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ | جيبكو | 15250061 | |
| ZO-1 الأجسام المضادة متعددة النسيلة ؛ | ThermoFisher | 61-7300 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680 المترافقة AffiniPure Donkey المضادة للفأر LgG (H + L) Jackson | ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 بئر ، | بلاستيك أوليمبوس | القاع 25-106 | |
| RIPA عازلة (5X) Alfa | Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | لمسح أغشية اللطخة الغربية |
المراجع
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
