Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.
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Artículo de método
Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana
En este artículo
Resumen
Resumen
La barrera hematoencefálica BBB consiste en células endoteliales que forman una barrera entre la circulación sistémica y el cerebro para evitar el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas. Las uniones estrechas (TJ) sellan eficazmente el espacio paracelular en las monocapas, lo que resulta en una barrera intacta. Este estudio describe un ensayo de fluorescencia basado en LY que sepuede utilizar para determinar su coeficiente de permeabilidad aparente (aplicación P) y a su vez se puede utilizar para determinar la cinética de la formación de monocapas confluentes y la unión estrecha resultante integridad de barrera en las monocapas hCMEC/D3. Demostramos además una utilidad adicional de este ensayo para determinar la integridad funcional de TJ en células transinfectadas. Nuestros datos del ensayo de laaplicación LY P muestran que las células hCMEC/D3 sembradas en una configuración transwell limitan efectivamente el transporte paracelular LY 7 días de cultivo. Como utilidad adicional del ensayo presentado, también demostramos que la transfección de nanopartículas de ADN no altera el transporte paracelular LY en monocapas hCMEC/D3.
Introducción
La barrera hematoencefálica (BBB) es la barrera protectora que limita la afluencia de componentes plasmáticos en el tejido cerebral y consiste en células endoteliales cerebrales junto con células de apoyo como los pericitas. El papel principal de BBB es servir como barrera que sella el espacio entre la sangre periférica y elsistema nervioso central (SNC) para mantener la hemostasis del microambiente neural 1,2. Las células endoteliales capilares cerebrales sellan eficazmente la vía paracelular a través de la formación de uniones estrechas intercelulares (TJ)1. Esta barrera protectora pe....
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Protocolo
1.Cultivo celular general hCMEC/D3
- Reanimación de células congeladas
NOTA: Todos los experimentos y mantenimiento del cultivo celular se realizaron dentro de una campana de bioseguridad estéril. Los medios de cultivo, los suplementos y los reactivos se compraron como productos estériles o se esterilizaron mediante filtración utilizando un filtro de membrana de 0,22 m para evitar la contaminación microbiana.- Añadir 8,5 ml de solución de colágeno (0,15mg/ml) en un matraz de cultivo tisular (75 cm2 de área de crecimiento; referida a partir de ahora como T75) y colocarla en una incubadora (37 oC, 5% CO2)durante 1....
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Resultados
En primer lugar, determinamos el efecto del tiempo de cultivo en la permeabilidad LY para determinar la cinética aparente de la formación de TJ. Los valores medios de laaplicación LY P del día 1 a 10 post de la sesión se muestran en la Figura 2a. En el día 1, laaplicación P media era de 4,25 x 10-4 cm/min y cayó ligeramente a 3,32 x 10-4 cm/min el día 2. El valor medio de laaplicación P aumentó ligerament.......
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Discusión
Un papel clave del BBB es prevenir el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas entre la circulación sistémica y el cerebro para mantener la hemostasis del microambiente neural. Una de las características características del BBB es la capacidad de las células endoteliales capilares para formar uniones estrechas (TJ) que sellan eficazmente la ruta paracelular de transporte. Demostramos un ensayo deaplicación LY P como un método cuantitativo para determinar la cinética aparente de la formación de b.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos por el apoyo financiero del Premio Nuevo Investigador 2017 de la Asociación Americana de Farmacia, un premio Hunkele Dreaded Disease de la Universidad Duquesne y la Escuela de Fondos de Inicio de Farmacia para el laboratorio Manickam. Nos gustaría agradecer al laboratorio Leak (Universidad de Duquesne) por la asistencia de la hincha occidental y la autorización del uso de su imagen de 16 bits de Odyssey. También nos gustaría incluir una nota especial de agradecimiento para Kandarp Dave (laboratorio Manickam) para obtener ayuda con la hincha occidental.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Línea celular hCMEC/D3 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | línea celular endotelial microvascular cerebral humana |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | ADN plasmídico que codifica el gen de la luciferasa, |
| lucifer, amarillo, CH, sal de dilitio | Invitrogen | 155267 | |
| Insertos Transwell con membranas grabadas con trazas de tereftalato de polietileno (PET) | Falcon | 353095 | |
| Matraz de cultivo de tejidos | Olympus Plastics | 25-207 | |
| plano de 24 pocillos | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Placas inmunológicas negras de 96 pocillos | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner - medio esencial mínimo (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Medio basal de células endoteliales-2 (EBM-2) |
| solución salina tamponada con fosfato 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Colágeno Tipo I | Discovery Labware, Inc. | ||
| Kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reactivo de lisis de cultivo celular 5X | Promega | E1531 | |
| Escarabajo Luciferina, Sal de Potasio | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Lector de placas de fluorescencia | Molecular Devices | |
| Solución de azul de tripano, 0,4 % | Gibco | 15250061 | |
| anticuerpo policlonal ZO-1 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anticuerpo anti-GAPDH | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugado AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 pocillos, fondo plano | Olympus Plastics | 25-106 | |
| Tampón RIPA (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Generador de imágenes Odyssey CLx | LI-COR Biosciences | para el escaneo de membranas de Western blot |
Referencias
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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Reimpresiones y permisos
