Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi
Summary
Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.
Abstract
Mitokondri temel organellerin hücre metabolizması ve hayatta kalmak için vardır. Önemli olaylar çeşitli hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve Apoptozis gibi mitokondri içinde yer alır. Sonuç olarak, mitokondrial disfonksiyon antifungal ilaç hoşgörü ve patojenik mantar virülans önemli bir rol oynamaya bildirilmektedir. Son veri mitokondri önemini mantar patogenezinde önemli bir katkı olarak tanınması da açmıştır. Mitokondri mantar Biyolojide önemini rağmen onun işlevini anlamak için standartlaştırılmış yöntemler kötü geliştirilir. Burada, çalışma Bazal oksijen tüketim oranını (OCR), bir ölçü mitokondrial solunum ve ekstraselüler asitleştirme oranları (D.H.T.), C. albicans suşları glycolytic işlevinde bir ölçü için bir yordam mevcut. Burada açıklanan yöntemi herhangi bir soy Candidaspp. mitokondri sağlam mantar hücrelerden arındırmak için gerek kalmadan uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı Ayrıca özelleştirilebilir için C. albicans suşları mitokondriyal işlevde inhibitörleri ekran.
Introduction
İnvazif mantar enfeksiyonları yılda dünya çapında 1,5 milyonun üzerinde kişi öldür. Yaşlı, prematüre bebeklerde, organ nakli alıcılar ve kanser hastaları1de dahil olmak üzere tehlikeye dokunulmazlık ile yaşayan insanların sayısında bir artış nedeniyle yükselişte sayıdır. C. albicans insan mikrofloranın parçasıdır fırsatçı bir insan mantar patojen var. Bu da Mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem komensal bir organizma olarak yaşıyor. C. albicans bağışıklık eksiklikler, kim cerrahi undergone ya da kim uzun kursları antibiyotik ile tedavi edilmiş olan kişilerde ciddi sistemik hastalık üretir. Candida türleri sırası Nozokomiyal enfeksiyon hastalıkları (NID) insanlar2,3,4,5,6,7ilk üç-dört nedenleri arasında. Candida kan dolaşımına enfeksiyonların yıllık genel sayısı ~ 400.000 talepleriyle ilişkili Scotlan 46-%751olduğu tahmin edilmektedir. Kandidiyazis nedeniyle yıllık mortalite yaklaşık 10.000 ABD tek başına olduğunu. NID mantarlar tarafından neden olduğu ölçüde astronomik hasta giderleri5‘ da yansıtılır. Amerika Birleşik Devletleri’nde, yıllık masraf invazif mantar enfeksiyonları tedavisi için $2 milyar, zaten aşırı yüklenmiş sağlık sistemi için çok büyük bir yük ekleyerek aşan. Şu anda, mevcut standart antifungal tedavilerin toksisite, giderek yaygın ilaç direnci ve ilaç-ilaç etkileşimleri nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri neden olur yeni antifungal ilaç hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, yeni ilaçlar mantar hedef üstünde hareket keşfi mantarlar ökaryotlarda olduğundan karmaşıktır. Bu büyük ölçüde özel mantar uyuşturucu hedef sayısını sınırlar.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondri hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve apoptosis8 için önemli olduğundan mitokondri mantar virülans için önemli bir katkı ve antifungal ilaçlar için hoşgörü olduğunu belirttiler ,9,10,11. Glycolytic ve glycolytic metabolizma C. albicans hayatta memeli ev sahibi12,13,14,15,16için önemlidir. Ayrıca, birkaç C. albicans mutantlar mitokondrial proteinler, Goa1 gibi eksik Srr1, Gem1, Sam37 vb filamentation, bir önemli virülans faktörü C. albicans17, arızalı olduğu gösterilmiştir 18 , 19 , 20 , 21 , 22. buna ek olarak, bu mutant Ayrıca, bir fare modeli virülans kandidiyazis17,18,19,20,21 Dissemine için zayıflatılmış gösterildi ,22. Böylece, mantar mitokondri ilaç keşfi için cazip bir hedef gösterir. C. albicans mitokondrial genom yaşayamaz anlamına gelir petite negatif23, çünkü ancak, C. albicans mitokondriyal işlevde çalışmanın meydan okuyor.
Burada, biz C. albicans mitokondrial ve glycolytic işlevinde mitokondri arındırmak için gerek kalmadan araştırmak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem aynı zamanda genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörler C. albicansmitokondrial ve glycolytic yollar üzerindeki etkisini araştırmak için optimize edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioenergetics mitokondriyal işlev oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ölçerek okumak için mükemmel bir araç olarak hizmet veren ilave akı tahlil-bağımlı oksijen tüketimi içinde gerçek-zaman. Buna ek olarak, bir hücre dışı asitleştirme oranı (ekstrasellüler pH değişikliği) olarak ölçülen glycolytic bir fonksiyonu da aynı anda gerçek zamanlı analiz soruşturma olmaktır.
PDL kaplamalı plakalar hücrelerde kuluçka izin verdiğinden tahlil plakasına uygun hücrelere <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NC laboratuarında Araştırma Ulusal kurumları Sağlık (NIH) grant R01AI24499 ve bir New Jersey Sağlık Vakfı (NJHF) grant, #PC40-18 tarafından desteklenir.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
