Solide-soutenus, sans protéines, double membranes bicouches phospholipidiques (DALG) peuvent être transformés en réseaux de nanotube de lipides complexes et dynamiques et peuvent servir de modèles 2D de bas en haut du réticulum endoplasmique.
Nous présentons une méthode commode pour former un modèle ascendant organelle structurels pour le réticulum endoplasmique (re). Le modèle est constitué de nanotubes de lipidiques très denses qui sont, en termes de morphologie et dynamique, qui rappelle d’ER. Les réseaux sont issus de parcelles de membrane double bicouche phospholipidique adhérant sur un transparent Al2O3 support. L’adhérence est médiée par Ca2 + dans le tampon ambiant. Appauvrissement ultérieur de Ca2 + par le biais de BAPTA/EDTA provoque la rétraction de la membrane, entraînant la formation de réseau pour le nanotube lipides spontanée. Seulement, la méthode compose de phospholipides et surfaces microfabriques pour formation simple d’un modèle ER et ne nécessite pas l’ajout de protéines ou d’énergie chimique (p. ex., GTP ou ATP). Contrairement à la morphologie 3D du réticulum endoplasmique cellulaire, le modèle est à deux dimensions (bien que le nanotube dimensions, géométrie, structure et dynamique est maintenue). Ce modèle unique en vitro ER se compose de seulement quelques éléments, est facile à construire et peut être observé sous un microscope optique. La structure résultante peut être décorée de plus pour des fonctionnalités supplémentaires, telles que l’ajout de protéines associées à l’ER ou de particules pour étudier les phénomènes de transport entre les tubes. Les réseaux artificiels décrites ici sont des modèles structurels appropriés pour le cellulaire ER, dont la morphologie caractéristique unique s’est avérée être liée à sa fonction biologique, alors que les détails concernant la formation du domaine tubulaire et réarrangements dans ne sont pas encore entièrement compris. Nous notons que cette méthode utilise Al2O3 thin-film-coated microscopie lamelles, qui sont disponibles dans le commerce mais qui nécessitent des commandes spéciales. Par conséquent, il est conseillé d’avoir accès à une installation de microfabrication pour la préparation.
Le ER effectue des tâches cruciales dans la cellule biologique dont le repliement des protéines, la synthèse des lipides et calcium règlement1,2. La morphologie de l’ER est intrinsèque aux fonctions qu’il effectue. Il combine des piles planaires et domaines tubulaires dense-dynamique, qui continuellement interagir avec le cytosquelette et subissent des restructurations et constamment en mouvement. Le remodelage que subissent des structures ER parmi la transformation continue entre feuilles planes et de tubes, de la formation de vésicules ou de fusion au lumen ER, allongement des tubes préexistants, rétraction du tube, fusion et casse3. La structure particulière des réseaux tubulaires est énergétiquement défavorable. Les voies et les mécanismes par lesquels l’ER génère et maintient cette organisation, ainsi que la façon dont il s’agit de sa fonction n’est pas encore totalement comprises4,5.
On sait que l’ER fonctionne mal quand il perd son état homéostatique, ayant pour résultat une condition causée par une augmentation de la synthèse des protéines, l’accumulation de protéines mal repliées, ou changements de Ca2 + et équilibre oxydatif, stress du re. ER stress à son tour provoque la déformation de la morphologie naturelle de l’organite, spécifiquement en perturbant le réseau organisation6,7. En réponse, la cellule active un mécanisme de réparation pour retourner à un état homéostatique. Panne en réparation peut conduire à l’apoptose cellulaire induite par l’ER, qui contribue à plusieurs maladies métaboliques et dégénératives comme la maladie d’Alzheimer, le diabète de type 2, maladie de Parkinson, sclérose latérale amyotrophique et plusieurs autres7, 8. La recherche actuelle vise l’organisation des réseaux ER tubulaires, et plusieurs études mettent l’accent sur la reconstitution de l’ER in vitro2. Existent quelques modèles2,9,10 ont besoin de protéines pour initier et maintenir la membrane courbure3,11 et aider l’organite atteindre sa forme. De toute évidence, les systèmes de modèles qui reflètent quelques-unes des principales caractéristiques structurelles et organisationnelles de l’ER et donnent accès à des études expérimentales avancées sont en grande demande.
Nous présentons ici les procédures pour la préparation d’un modèle dynamique, apport énergétique le in vitro facile, protéine/produit chimique pour la ER, fournissant une plateforme de base pour étudier la morphologie de l’ER et fonctions associées4. Dans cette méthode, un modèle ER est fabriqué avec une approche bottom-up en utilisant seulement quelques éléments, dans lequel les molécules d’intérêt peuvent être intégrées pour ajouter à la complexité. Le réseau représente la dynamique et la structure de l’ER. En outre, transformation réversible entre la membrane plane et les tubes, formation de vésicules des tubes, tube fusion, glissant et rétraction peut tout observer. En plus de servir comme un modèle de bas en haut pour la ER cellulaire incomplètement comprise, l’itinéraire de lipides à nanotube réseaux décrits dans le présent protocole peut être applicable pour les chercheurs qui étudient l’auto-assemblage, nanofluidics, molécule unique et colloïde phénomènes de transport, le flux de Marangoni et autres domaines concernant. Les blocs de construction seulement moléculaires utilisées dans notre méthode sont les phospholipides. Le protocole exige peu de laboratoire et l’équipement de base et est accessible pour l’incorporation des éléments supplémentaires.
Dans la discussion qui suit, les étapes critiques et modifications éventuelles limitations du protocole sont décrits. La première étape critique est le montage de la chambre d’observation, étant donné que l’adhérence de l’image PDMS à l’Al2O3 surface est intrinsèquement faible. Dans le cas où le cadre n’adhère pas au substrat correctement, le contenu provoquera une fuite de la chambre de l’observation et l’expérience va s’arrêter. Les principaux facteurs qui entravent la bonne étanchéité de la surface et le cadre sont 1) l’absence de nettoyage en profondeur de l’armature PDMS (réutilisé) et 2) bulles qui parfois obtenir emprisonnés entre châssis et substrat d’air. Un cadre PDMS nouvellement préparé ou completement nettoye doit être utilisé. Le cadre doit être rincé avant et après chaque utilisation avec de l’isopropanol, suivie d’un rinçage avec l’eau distillée et brushing avec de l’azote. L’Al2O3 surfaces n’exigent pas n’importe quel nettoyage préalable, car ils sont fabriqués dans un environnement de salle blanche et conservés dans des contenants hermétiques jusqu’à utilisation. En raison du caractère amphotère Al2O3, il ne devrait pas être exposé à des solutions fortement acides ou basiques. Autres modèles pour la chambre d’observation peuvent être employées, selon l’accessibilité de l’installation individuelle. Caractéristiques importantes de cette chambre sont un accès gratuit à l’échantillon liquide de l’ouverture supérieure et l’inertie du matériau cadre en ce qui concerne les solutions utilisées et les échantillons. Les dimensions de la chambre sont également un facteur important, car elles devraient accueillir un volume de 0,5 à 1 mL. Puisque les surfaces utilisées sont généralement de taille standard des lamelles (24 x 60 mm), le volume de la chambre est principalement déterminé par l’épaisseur du cadre. À notre connaissance, les entretoises à l’ampleur et la profondeur qui peut accueillir le volume des échantillons généralement géré par le présent protocole ne sont pas disponibles dans le commerce. Nous avons donc consacré un article dans le protocole pour les détails de la fabrication et l’assemblage d’un cadre de chambre d’échantillon.
L’autre étape critique dans le présent protocole est l’échange de la mémoire tampon. Un défi dans cette étape est le moment choisi pour effectuer cet échange. La diffusion de la canalisation principale lors du contact avec le substrat de3 Al2O est instantanée, et l’expansion continue de le DALG conduit à sa rupture, clôturant l’expérience (Figure 2A, B). Par conséquent, la diffusion doit être constamment surveillée, et l’échange de la mémoire tampon doit être effectuée dans un délai raisonnable. L’échange ne doit pas être exécuté trop rapidement après l’initialisation de la diffusion, afin de permettre les patchs de membrane atteindre une taille optimale (100 à 200 µm de diamètre). En revanche, adhérence continue sur la surface provoque la tension membranaire élevé, ce qui conduit à une rupture. Ainsi, membrane tous les correctifs éventuellement rupture si l’épandage n’est pas interrompu. Le moment de la rupture est différente pour chaque patch, puisque cela dépend de la taille et la structure interne de la canalisation principale et l’accessibilité des lipides qui y sont. Par conséquent, au moment de l’échange doit être disposé à un validant au cours de laquelle les patchs non rompus avec les tailles optimales représentent la majorité de l’ensemble de la population. Un autre défi dans l’étape d’échange tampon est le taux de suppression et ajout des tampons. Effectuer cette substitution trop rapidement a un effet néfaste sur les structures de membrane final (Figure 2C-E). L’extraction excessive de la Ca2 +– un tampon HEPES sans laisser un mince film de liquide sur le substrat, se traduit par patchs membrane séchés et irréversiblement déformées (Figure 2C). Même s’il subsiste une quantité adéquate de liquide sur la surface, addition brusque du tampon HEPES-chélateur provoque également des perturbations des structures membranaires. Figure 2 D,E , montre l’aspect typique des patchs de membrane hydrodynamique perturbé. Les perturbations dans l’ensemble morphologique n’influencent pas nécessairement les propriétés dynamiques des structures finales (c’est-à-dire, les réarrangements tubulaires dans les zones restantes se produira encore). Cependant, il deviendra difficile d’observer la transformation matérielle sur les structures déformées. Par exemple, dans la Figure 2D, il serait difficile de déterminer la direction vers laquelle se rétracte MLV le DALG.
Une éventuelle modification du protocole est la composition lipidique utilisée. L’accent a été mis sur les phospholipides qui dominent la composition ER chez les mammifères et16 de levure (e. g., la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE) et le phosphatidylinositol (PI). Les expériences initiales ont été effectuées à l’aide de mélanges de PC et PI4. Dans les résultats présentés, un mélange de PC et de DOPE et un dérivé du PE a été utilisés. Cependant, pas toutes les compositions lipidiques arbitraires ont été trouvées pour créer les structures tubulaires obtenues par le biais de ce protocole. Quelques-uns des autres mélanges lipides étudiées expérimentalement impliquent cœur total extrait, extrait de haricot de soja polaire, e. coli polaire, mélanges de PC avec stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) dans des proportions variables et mélanges de PC-PE-PI-Posphatidyl sérine (PS) en proportions variables. Car structures à membrane tubulaire possèdent des courbures hautes nécessitent la disposition particulière des molécules lipidiques individuels, il est prévu que le phénomène observé est lipidique composition spécifique.
Une autre modification appliquée dans le présent protocole est la méthode pour la fabrication de la surface. Ici, l’ALD a été utilisé pour fabriquer l’Al2O3 enduit lamelles couvre-objet. Cela diffère de la méthode de dépôt rapportées,4de pulvérisation réactive. Tandis que ceci indique qu’une méthode alternative de fabrication surface peut entraîner encore tubulation ER-comme, une limitation importante semble être la spécificité du matériau de la surface. Le mode de propagation et de la force d’adhérence dépend beaucoup de propriétés du matériau de la surface, qui influence sur des facteurs tels que les interactions électrostatiques, mouillabilité, hydrophobie et la rugosité de la surface. Al2O3 surfaces offrent une adhérence optimale et films lipidiques peuvent tous deux attacher assez fortement à se propager comme une membrane de bicouche lipidique double et se détacher de constituer des réseaux tubulaire lors du retrait des ions Ca2 + . Nous avons testé précédemment la même expérience avec la SiO2, dans lequel les vésicules multilamellaires s’est répandu comme une membrane de bicouche lipidique double, mais aucune formation réseau tubulaire a été observée lors de l’addition de chélateurs17. La fixation et la formation des tubes sont observés uniquement sur Al2O3 ou plasma gravé Al18. Nos enquêtes ont révélé que le paramètre contributif menant à un tel phénomène est la fonction Zêta de potentiel des surfaces et pour lesquels Al Al2O3 étaient proches de zéro (mV) et SiO2 nettement défavorable. Le potentiel zêta de borosilicate est similaire à SiO219; par conséquent, adhérence du film lipidique sur le borosilicaté est tout aussi forte et irréversible. En fait, lipides multilamellaires réservoir contact avec des surfaces de borosilicate mène habituellement à la rupture immédiate et de la formation des lipides simples bicouches20. L’Al2O3 surfaces requis pour que ce protocole ne sont pas facilement ou commercialement disponibles. Ils peuvent, toutefois, être commande de fabricants de verre et substrat de spécialités. Accès à la salle blanche avec des équipements de fabrication de couches minces est fortement recommandée.
Les autres méthodes existantes de bas en haut pour fabriquer des réseaux tubulaire type ER2,10 impliquent des protéines ainsi que d’entrée de l’énergie chimique (p. ex.., ATP et GTP). Rapoport et collègues2 a signalé la formation de réseaux-ER sur verre couvre-objet en vitro en mélangeant les protéines membranaires-flexion présentes dans urgences, avec des phospholipides et GTP. Le travail de m. Bachand et al. 10 montre comment ces réseaux tubulaire dynamiques peut être créés en utilisant des moteurs moléculaires et l’ATP comme source d’énergie. Ce protocole présenté ne nécessite pas de protéines membranaires ou hydrolyse de composés organiques pour l’énergie. Les seuls éléments essentiels sont le substrat solid et les phospholipides. Purification et extraction des protéines ne sont pas exigés. Ce protocole prévoit, en termes de simplicité des molécules constitutives, le plus simple modèle ER.
Avec ce modèle de ER base, base de lipides mis en place, mise en place de complexité en ajoutant les composants associés à ER est intéressant, puisqu’il permet aux enquêtes des impacts individuels sur le système. Similaire aux réseaux ER réelles, les tubes dans le modèle sont dynamiques. La conjugaison d’et la migration des protéines membranaires étiquetées ou particules fluorescentes dans tout le réseau tubulaire, peuvent donner des informations sur la direction du mouvement de la membrane. Encapsulation et la surveillance des liquides à l’intérieur du DALG et tubes fluorescents au cours de la transformation et une cartographie possible du transport contenu intratubulaires pourraient servir une autre mise au point. Enfin, une transition entre le modèle ER 2D résultant de ce protocole vers un modèle 3D de ER lisse peut-être être adoptée par encapsulation des réseaux dans les architectures d’hydrogel.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le professeur Aldo Jesorka de la Chalmers University of Technology en Suède pour ses précieux commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien financier provenant de la subvention de projet de recherche du Conseil de la Norvège (Forskningsrådet) 274433, UiO : Sciences de la vie environnement de Convergence, le Conseil de recherche suédois (Vetenskapsrådet) projet subvention 2015-04561, ainsi que le financement de démarrage fourni par le Centre for Molecular Medicine Norvège & faculté de mathématiques et de Sciences naturelles à l’Université d’Oslo.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |