I Vitro differentiering Model af menneskets normale hukommelse B celler til langlivede plasmaceller

Summary

Brug Multi-trins kultur systemer, rapportere vi en in vitro-B-celle til plasma celle differentiering model.

Abstract

Plasma celler (pc’er) udskiller store mængder af antistoffer og udvikle fra B-celler, der er blevet aktiveret. Pc’er er sjældne celler i knoglemarven eller slimhinde og sikre humorale immunitet. På grund af deres lave hyppighed og placering, studiet af pc’er er vanskeligt i human. Vi rapporterede en B til PC in vitro-differentiering model ved hjælp af udvalgte kombinationer af cytokiner og aktivering molekyler, der gør det muligt for at gengive sekventielle Celledifferentiering sker in vivo. I denne in vitro model, hukommelse B-celler (MBCs) vil differentiere i pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidligt pc’er og endelig til langlivede tæt pc’er, med en fænotype med deres modstykker i raske personer. Vi har også bygget en åben adgang bioinformatik værktøjer til at analysere de mest fremtrædende oplysninger fra GEP data relateret til PC differentiering. Disse ressourcer kan bruges til at studere menneskelige B til PC differentiering og i den aktuelle undersøgelse, vi undersøgte udtryk genregulering af epigenetiske faktorer under menneskelige B til PC differentiering.

Introduction

Differentiering af B-celler til plasma celler (pc’er) er afgørende for humorale immunitet og beskytte værten mod infektioner¹. B at differentiering af PC er forbundet med større ændringer i transskription kapacitet og stofskifte til at rumme at antistof sekretion. Transkriptionsfaktorer, der styrer B til PC differentiering er blevet grundigt undersøgt og afsløret eksklusive netværk herunder B – og PC-specifikke transskription faktorer (TFs)². I B-celler er PAX5, BCL6 og BACH2 TFs vogtere af B-celle identitet^2,3. Induktion af IRF4, PRDM1 BLIMP1 og XBP1 PC TF-kodning vil slukke B celle gener og fremkalde en koordineret antistof-secernerende celle transcriptional program^3,4,5. Disse koordineret transcriptional ændringer er forbundet med Ig gener transskription aktivering sammen med et skift fra formen membran-bundet til formularen udskilles af immunoglobulin tunge kæde^{2,3, 4}. B til PC differentiering er forbundet med induktion af gener involveret i endoplasmatiske reticulum og Golgi apparatet fungerer samtidig med udfoldet protein svar (UPR) aktivering kendt for at spille en nøglerolle i PC af imødekommende syntesen af udskilles immunoglobuliner^6,7. TF XBP1 spiller en stor rolle i denne cellulære tilpasning^8,9,10.

B-celler og pc’er er centrale aktører i humorale immunitet. Forstå biologiske processer, der styrer produktionen og overlevelse af normale plasma celler er kritisk i terapeutiske indgreb, som skal sikre effektiv immunrespons og forhindre autoimmunitet eller immundefekt. PC er sjældne celler med differentiering vorden finder sted i anatomiske steder, der hæmmer fuld biologiske karakterisering, især i human. Brug Multi-trins kultur systemer, har vi rapporteret en in vitro-B til PC differentiering model. Denne model gengiver den sekventielle Celledifferentiering og modning forekommer i de forskellige organer i vivo^11,12,13,. I et første skridt, hukommelse B-celler er først aktiveret for fire dage af CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombination og differentiere i preplasmablasts (PrePBs). I et andet trin, er preplasmablasts tilskyndet til at differentiere i plasmablasts (PBs) ved at fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulation og ændre cytokin kombination. I en tredje trin, er plasmablasts tilskyndet til at differentiere i tidlige pc’er ved at ændre cytokin kombination^11,12. En fjerde trin blev indført for at få fuldt modne pc’er ved dyrkning af disse tidlige pc’er med knoglemarv stromale celler aircondition medium eller valgt vækstfaktorer¹³. Disse ældre pc’er kunne overleve flere måneder in vitro- og udskiller store mængder af immunglobulin (figur 1). Interessant, sammenfatter vores in vitro-modellen de koordinerede transcriptional ændringer og fænotype af forskellige B til PC faser, der kan blive opdaget i vivo^{11,12,13,14 ,15}. Pc’er er sjældne celler og vores in vitro-differentiering model giver mulighed for at studere menneskelige B til PC differentiering.

Protocol

Protokollen følger retningslinjer i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og aftale af Montpellier Universitet Hospital Centre for biologiske ressourcer. 1. i Vitro Normal Plasma celle differentiering Model Bemærk: Pc’er der genereres gennem en fire-trins kultur11,12,13. B-celle forstærkning og differentiering B…

Representative Results

Den generelle procedure af in vitro-normal PC differentiering er repræsenteret i figur 1. Ved hjælp af protokollen præsenteres her, kan vi generere tilstrækkelig mængde af celler, der ikke kunne opnås med ex vivo menneskelige prøver. Selv om rollen, de komplekse netværk af transskriptionsfaktorer involveret i PC differentiering er blevet undersøgt, forbliver de mekanismer, der regulerer nøgle PC differentiering transskription netværk dårligt kendt…

Discussion

I human, PC er sjældne celler med differentiering stadier finder sted i anatomiske steder, der hæmmer fuld biologiske karakterisering. Vi har udviklet en in vitro-B til PC differentiering model ved hjælp af flertrins kultur systemer hvor forskellige kombinationer af aktivering molekyler og cytokiner anvendes efterfølgende for at gengive sekventielle celle differentieringen forekommer i den forskellige organer/væv i vivo^{11,12,13</…}

Materials

anti-CD2 magnetic beads	Invitrogen	11159D
Anti-CD138-APC	Beckman-Coulter	B49219
Anti-CD19-APC	BD	555415
Anti-CD20-PB	Beckman-Coulter	B49208
Anti-CD27-PE	BD	555441
Anti-CD38-PE	Beckman-Coulter	A07779
Anti-histidine	R&D Systems	MAB050
CpG ODN(PT)	Sigma		T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin	Sigma-Aldrich	T3309
IFN-α	Merck	Intron A
IMDM	Gibco	31980-022
Recombinan Human CD40L-hi	R&D Systems	2706-CL
Recombinant Human APRIL	R&D Systems	5860-AP-010
Recombinant Human IL-10	R&D Systems	217-IL-
Recombinant Human IL-15	Peprotech	200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D Systems	202-IL-
Recombinant Human IL-6	Peprotech	200-06