Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Summary

Här presenterar vi ett elegant protokoll för i vivo utvärdering av vaccin effektivitet och värd immunsvar. Detta protokoll kan anpassas för vaccin-modeller som studerar virala, bakteriella, eller parasitic patogener.

Abstract

Vaccin är ett 20^th talet medicinsk underverk. De har dramatiskt minskat sjuklighet och dödlighet orsakad av infektionssjukdomar och bidragit till en slående ökning av medellivslängden i världen. Dock fortfarande att fastställa vaccinets effekt en utmaning. Nya bevis tyder på att det nuvarande acellulärt vaccinet (aPV) för Bordetella pertussis (B. pertussis) inducerar suboptimala immunitet. En stor utmaning är därför att utforma nästa generation vaccin som inducerar skyddande immunitet utan de negativa biverkningarna av hela-cell vaccin (wPV). Här beskriver vi ett protokoll som vi använde för att testa effekten av en lovande, Roman adjuvant som förvränger immunsvar mot en skyddande Th1/Th17-fenotyp och främjar en bättre clearance B. pertussis utmaning från murina luftvägarna. Denna artikel beskriver protokollet för mus immunisering, bakteriell Inympning, vävnad skörd och analys av immunsvar. Med denna metod, inom vår modell har vi framgångsrikt klarlagd avgörande mekanismer framkallas av ett lovande, nästa generations acellulärt pertussis-vaccin. Denna metod kan tillämpas på någon smittsam sjukdom modell för att fastställa vaccinets effekt.

Introduction

Vaccin utgör en av de största framgångarna för folkhälsan av 1900-talet, men vi fortfarande helt förstår inte de mekanismer genom vilka framgångsrika vacciner stimulera skyddande immunitet. Identifiering av molekylära signaturer (t.ex., cell aktivering markörer, expansion av cellulära undertyper och mönster av genuttryck) inducerad efter vaccination ger en uppsjö av information för att förutsäga och genererar en effektiv immunsvar. Komplexiteten i värd-patogen Svaren kan inte replikeras på lämpligt sätt använda i vitro cell kultur system¹. In vivo vaccin modeller är utformade för att samtidigt utvärdera flera typer av immunceller i värden. Detta ger en fördel vid kännetecknar vaccine antigen bearbetning och presentation, differentiell cytokin sekretion och utbyggnad av immunceller. Protokollet beskrivs här ger en detaljerad metod för att fastställa vaccinets effekt genom utvärdering av systemisk och lokal immunsvaret och kvantifiering av patogen börda i vävnader av intresse. Det exempel som ges här testar effekten av en experimentell vaccin för patogen Bordetella pertussis (B. pertussis).

B. pertussis är en gramnegativ bakterie som är den etiologiska agenten av respiratorisk sjukdom kikhosta (pertussis)^2,3. Nära kontakt med infekterade individer (symtomatisk eller asymtomatisk) leder till överföring, colonization och sjukdom. Trots betydande globala vaccin täckning⁴, kikhosta anses en framvällande sjukdom i många länder runt om i världen och är en viktig orsak till förebyggas barndom dödsfall^{5,6,7, 8}. under 2015 B. pertussis och kikhosta ingick i den nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) framväxande pathogen/infektionssjukdomar lista, betonar behovet av utveckling av en bättre vaccin som ger långlivat skyddande immunitet.

Ett aktivt område undersökning för att kontrollera kikhosta återkomsten är för närvarande utveckling av nästa generations acellulärt pertussis vaccin (aPV) med en optimal kombination av romanen adjuvans och antigener att efterlikna det immunsvar som framkallas av hela-cellen kikhosta vaccin (wPV)⁹. Använder protokollet beskrivs rapporterade vi nyligen att ändringen av en nuvarande FDA-godkända aPV genom tillsats av en roman adjuvant, Bordetella colonization faktor A (BcfA), resulterade i mer effektiv minskning av B. pertussis bakteriehalten från mus lungorna^10,11. Detta ökade skydd åtföljdes av den skeva av ett alun-inducerad Th1/Th2-immunsvar mot de mer skyddande Th1/Th17 immun profil¹⁰. Detta protokoll är detaljerad och heltäckande, gör det möjligt för utredaren att få maximal information genom samtidig utvärdering av värd- och immunsvar mot olika patogener.

Protokollet beskrivs här följer representativa vaccin schemat, visas i figur 1, att säkerställa optimal värd immunsvar.

Protocol

Alla experiment med levande djur genomfördes efter ett protokoll som godkänts av The Ohio State University IACUC enligt IACUC riktlinjer. C57BL/6 möss användes i alla vaccinationer och infektioner. Såväl kvinnliga som manliga möss används i varje grupp enligt NIH riktlinjer. Antalet djur per grupp bestämdes av power beräkningar baserade på förväntade skillnader i resultatet mellan experimentella grupper. Exempelvis 8 möss per grupp kommer att ge 80% effekt vid α = 0,05 (2-sided) för 2-sample t- t…

Representative Results

Modellen beskrivs visar en metod för att utvärdera vaccin effektivitet och immunsvar under host-patogen interaktioner. Figur 1 illustrerar den representativa vaccin schema används för att vaccinera och infekterar möss och skörda vävnader för analys. Figur 2 visar inställningen av anestesi systemet sysselsatt att inducera möss, aktivera utredarna att leverera vaccinationer och bakteriell inoculums. F…

Discussion

Den omfattande protokoll som beskrivs här för att studera vaccin-inducerad immunitet mot B. pertussis infektion kommer också att tillåta utvärdering av värd Svaren till en mängd andra patogener. Protokollet beskrivs metoder att leverera vaccinationer, avgöra vaccin effekt följande patogener utmaning, och parallella dissekering av immunförsvaret. Anpassa protokollet för att studera andra patogener, skulle flera parametrar behöva ändras. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, funktionsläget…

Materials

2L induction chamber	Vet Equip	941444
Fluriso	Vet One	V1 501017	any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base	BD bioscience	248200
Casein	Sigma	C-7078
Casamino acids	VWR	J851-500G	Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid	Research Products Int	G36020-500
L-Proline	Research Products Int	P50200-500
Sodium Chloride	Fisher	BP358-10
Potassium Phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Potassium Chloride	Fisher	P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate	Fisher	M2670-500G
Calcium Chloride	Fisher	C75-500
Tris base	Fisher	BP153-1
L-cysteine HCl	Fisher	BP376-100	SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate	Sigma	F-7002
Niacin	Research Products Int	N20080-100
Glutathione	Research Products Int	G22010-25
Ascorbic acid	Research Products Int	A50040-500
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093
FBS	Sigma	F2442-500mL	any US source, non-heat inactivated
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15710064
B-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
15mL dounce tissue grinder	Wheaton	357544	any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer	Kontes/Sigma	Z359971-1EA	any similar brand is appropriate
Instruments – scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders			any brand is appropriate
3mL syringes	BD bioscience	309657
15mL conical tubes	Fisher	339651
1.5mL microfuge tubes	Denville	C2170
70um cell strainers	Fisher	22363548
60mm plates	ThermoFisher Scientific	130181
48-well tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2	Fisher Scientific/Excel Int.	14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-172-09