तंत्रिकाबंधार्बुद में Immunohistochemistry द्वारा आयल-एंबेडेड 3d तंत्रिकाबंधार्बुद Neurosphere संस्कृतियों का मूल्यांकन
Summary
Neurospheres 3 डी संस्कृतियों के रूप में उगाया तंत्रिकाबंधार्बुद जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का गठन । यहां हम immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान जबकि आयल embedding के माध्यम से तंत्रिकाबंधार्बुद neurospheres की 3d संरचना को बनाए रखने । इस विधि जैसे उपजी और तंत्रिका विभेद के रूप में तंत्रिकाबंधार्बुद neurosphere गुणों के लक्षण वर्णन करता है ।
Abstract
तंत्रिकाबंधार्बुद में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण अपनी विकृति के अध्ययन में कई पहलुओं के लिए प्रासंगिक है । कई प्रोटीन निदान, रोग का निदान, वर्गीकरण, ट्यूमर प्रगति की स्थिति, और सेल भेदभाव राज्य में अनुप्रयोगों के साथ के रूप में वर्णित किया गया है । तंत्रिकाबंधार्बुद रोगियों और तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल से उत्पन्न ट्यूमर neurospheres (एन एस) की विशेषता के लिए यह भी है कि इन मार्क्स का विश्लेषण उपयोगी है । ट्यूमर एन एस में एक मूल्यवान इन विट्रो मॉडल ट्यूमर है जिसमें से वे प्राप्त कर रहे हैं और अधिक सही तंत्रिकाबंधार्बुद जीव विज्ञान दर्पण कर सकते हैं की विभिन्न सुविधाओं का आकलन करने के लिए प्रदान करते हैं । यहाँ हम एक विस्तृत विधि का वर्णन करने के लिए ट्यूमर एनएस में immunohistochemistry (आइएचसी) का उपयोग कर तेल-एम्बेडेड ट्यूमर एनएस पर मार्क्स का विश्लेषण.
Introduction
ग्लियोमास विश्व स्वास्थ्य संगठन1के अनुसार उनके phenotypic और genotypic विशेषताओं द्वारा वर्गीकृत केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्राथमिक ठोस ट्यूमर हैं । इस वर्गीकरण की उपस्थिति या चालक उत्परिवर्तनों, जो2के एक आकर्षक स्रोत का प्रतिनिधित्व की अनुपस्थिति शामिल हैं । जैव मार्क्स जैविक विशेषताएं है कि मापा जा सकता है और सामान्य और रोग प्रक्रियाओं, साथ ही एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप करने के लिए औषधीय प्रतिक्रियाओं को इंगित करने के लिए मूल्यांकन कर सकते हैं3. जैव मार्क्स ट्यूमर ऊतक और तंत्रिकाबंधार्बुद से व्युत्पंन कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है, विभिंन पहलुओं में अपने जैविक लक्षण वर्णन सक्षम करने से । तंत्रिकाबंधार्बुद के कुछ उदाहरणों में isocitrate डिहाइड्रोजनेज 1 (IDH1), कम ग्रेड ग्लियोमास के एक उत्परिवर्ती एंजाइम विशेषता4बेहतर पूर्वानुमान के साथ जुड़े रूपांतरित होना शामिल हैं । रूपांतरित IDH1 अक्सर TP53 और अल्फा के साथ संयोजन में व्यक्त किया जाता है-thalassemia/मानसिक मंदता सिंड्रोम एक्स-लिंक्ड (ATRX)-उत्परिवर्तनों को निष्क्रिय, एक विशिष्ट तंत्रिकाबंधार्बुद उपप्रकार4,5परिभाषित । ATRX-निष्क्रिय उत्परिवर्तन भी बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमास2,6 के ४४% में होते है और आक्रामक ट्यूमर और जीनोमिक अस्थिरता6,7के साथ जुड़े रहे हैं । इसके अलावा, बाल चिकित्सा फैलाना आंतरिक pontine ग्लियोमास (DIPG) उपस्थिति या हिस्टोन H3 जीन H3F3A, या HIST1H3B में एक K27M उत्परिवर्तन की अनुपस्थिति के अनुसार उपसमूह में अंतर कर रहे हैं/सी जीन1,6। इसलिए, आणविक लक्षण वर्णन की शुरूआत उपखंड, अध्ययन, और अलग संस्थाओं के रूप में ग्लियोमास के उपचार, जो और अधिक प्रत्येक उपप्रकार के लिए और अधिक लक्षित चिकित्सा के विकास की अनुमति देगा परमिट । इसके अलावा, जैव चिह्नों के विश्लेषण apoptosis8, autophagy9, सेल चक्र प्रगति10, सेल जखीरे11, और सेल विभेदन 12 जैसे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .
आनुवंशिक रूप से मानव कैंसर में मौजूद आनुवंशिक घावों बंदरगाह कि पशु मॉडल है कि मध्यस्थता रोग प्रगति संकेत मार्ग के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं । हमारी प्रयोगशाला सो सौंदर्य (एसबी) transposase प्रणाली के उपयोग को लागू किया गया है आनुवंशिक रूप से तंत्रिकाबंधार्बुद विशिष्ट उत्परिवर्तनों कि दोहराऊंगा मानव तंत्रिकाबंधार्बुद13,14उपप्रकार के बंदरगाह के माउस मॉडल विकसित करने के लिए । इन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल ट्यूमर व्युत्पंन एनएस, जो एक 3 डी प्रणाली में इन विट्रो अध्ययनों में सक्षम,15 सीटू मेंट्यूमर में मौजूद मुख्य सुविधाओं को प्रतिबिंबित पैदा करने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, चूहों में एनएस के orthotopical ट्रांसप्लांटेशन प्राथमिक ट्यूमर की सुविधाओं को बनाए रखने और इसी प्राथमिक ट्यूमर15के histopathological, जीनोमिक, और phenotypic गुणों की नकल है कि माध्यमिक ट्यूमर उत्पन्न कर सकते हैं.
सीरम मुक्त संस्कृति में, स्टेम सेल गुणों के साथ मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को समृद्ध किया जा सकता है, और एपिडर्मल वृद्धि कारकों की उपस्थिति में (EGF) और fibroblast वृद्धि कारकों (FGF), वे एक सेल के रूप में उगाया जा सकता है-प्राप्त कालोनियों जैसे एनएस संस्कृतियों । इस चयनात्मक संस्कृति प्रणाली में, सबसे फर्क या विभेदित कोशिकाओं तेजी से मर जाते हैं, जबकि स्टेम सेल विभाजन और सेलुलर समूहों के रूप में । यह एक एन एस संस्कृति है कि तंत्रिकाबंधार्बुद ट्यूमर16,17,18सुविधाओं का कहना है की पीढ़ी की अनुमति देता है । तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस ट्यूमर जीव विज्ञान के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें निदान, रोग का निदान, वर्गीकरण, ट्यूमर प्रगति के राज्य, और कोशिका विभेदन राज्य में आवेदन किया है । यहां, हम विस्तार एक प्रोटोकॉल तंत्रिकाबंधार्बुद एन एस उत्पंन करने के लिए और तेल में 3 डी संस्कृतियों एंबेड आइएचसी धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । फिक्सिंग और तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस embedding का एक लाभ यह है कि एनएस की आकृति विज्ञान बेहतर पारंपरिक cytospin विधि19, जिसमें तंत्रिकाबंधार्बुद एन एस सेल पृथक्करण के लिए तनावपूर्ण हेरफेर के अधीन है और समतल बनने की तुलना में बनाए रखा है । इसके अलावा, embedding आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ट्यूमर एनएस से किसी भी अंतर्जात fluorophore अभिव्यक्ति बुझती, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा भर में धुंधला को सक्षम करने से । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक तेल embedding प्रक्रिया के माध्यम से तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं की 3d संरचना को बनाए रखने और immunohistochemistry का उपयोग कर तंत्रिकाबंधार्बुद neurospheres के लक्षण वर्णन सक्षम है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, हम विस्तार एक बहुमुखी और reproducible विधि पर immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए आयल-एंबेडेड तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस, जो ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषता 3d संरचना को बनाए रखने में सीटू मेंमस्तिष्क में …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया/मस्तिष्क संबंधी विकारों के राष्ट्रीय संस्थान & स्ट्रोक (NIH/NINDS) पलाश R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 को M.G.C.; NIH/NINDS पलाश R01-NS076991, R01-NS082311, और R01-NS096756 को P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; न्यूरोसर्जरी विभाग; लिआ के M.G.C. और P.R.L. को खुश दिल; और आरएनए M.G.C. F.M.M. के लिए F046166 अनुदान एक F31 NIH/NINDS-F31NS103500 द्वारा समर्थित है । जेपी एक फुलब्राइट द्वारा समर्थित था-अर्जेंटीना खेल और शिक्षा फैलोशिप मंत्रालय ।
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
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