Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer
Summary
Neurospheres odlas som 3D kulturer utgör ett kraftfullt verktyg för att studera gliom biologi. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra immunohistokemi bibehållen 3D-strukturen för gliom neurospheres genom paraffin inbäddning. Denna metod gör det möjligt för karakterisering av gliom neurosphere egenskaper såsom stemness och neurala differentiering.
Abstract
Analys av proteinuttryck i gliom är relevant för flera aspekter i studien av dess patologi. Många proteiner har beskrivits som biomarkörer med tillämpningar i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Dessa analyser av biomarkörer är också användbara att karakterisera tumör neurospheres (NS) genereras från gliom patienter och gliom modeller. Tumör NS ger en värdefull in vitro- modell för att bedöma olika funktioner av tumören från vilken de härrör och kan mer exakt spegel gliom biologi. Här beskriver vi en detaljerad metod för att analysera biomarkörer i tumör NS med immunhistokemi (IHC) på paraffin-inbäddat tumör NS.
Introduction
Gliom är primära solida tumörer i centrala nervsystemet klassificeras efter deras fenotypiska och genotypiska egenskaper enligt Världshälsoorganisationen1. Denna klassificering omfattar närvaron eller frånvaron av drivrutinen mutationer, som utgör en attraktiv biomarkörer2. Biomarkörer är biologiska egenskaper som kan mätas och utvärderas för att indikera normala och patologiska processer, liksom farmakologiska Svaren till en terapeutisk intervention3. Biomarkörer kan upptäckas i tumörvävnad och celler från gliom, gör det möjligt för dess biologiska karakterisering i olika aspekter. Några exempel på gliom biomarkörer muterade isocitrate dehydrogenas 1 (IDH1), en mutant enzym för lägre kvalitet gliom associerade med bättre prognos4karakteristiska. Muterade IDH1 uttrycks ofta i kombination med TP53 och alfa-thalassemi/mental retardation syndrom X-länkade (ATRX)-inactivating mutationer, definiera en specifik gliom subtyp4,5. ATRX-inactivating mutationer också förekommer i 44% av pediatric höggradigt gliom2,6 och har förknippats med aggressiva tumörer och genomisk instabilitet6,7. Dessutom är pediatric diffusa inneboende pontine gliom (DIPG) differentierade i undergrupper enligt närvaron eller frånvaron av en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Därför införandet av molekylär karakterisering tillåter den underavdelning, undersökning och behandling av gliomas som separata enheter, vilket gör mer utveckling av mer riktade terapier för varje subtyp. Dessutom kan en analys av biomarkörer användas för att utvärdera olika biologiska processer såsom apoptos8, autofagi9, cellcykeln progression10, cell spridning11och celldifferentiering12 .
Genmanipulerade djurmodeller som hysa de genetiska lesionerna i mänskliga cancerformer är kritiska för studien av signalering vägar som förmedlar sjukdomsprogression. Vårt laboratorium har infört användning av sovande skönhet (SB) transposase systemet att utveckla genetiskt modifierade musmodeller av gliom härbärgerat specifika mutationer som recapitulate mänskliga glioma subtyper13,14. Dessa genetiskt modifierade musmodeller används för att generera tumör-derived NS, som möjliggör in vitro- studier i en 3D-systemet presenterar spegling framträdande dragen i tumörer i situ15. Orthotopical transplantation av NS i möss kan också generera sekundära tumörer att behålla funktioner av den primära tumören och härma de histopatologiska, genomisk och fenotypiska egenskaperna av motsvarande primärtumör15.
I serumfritt kultur, hjärnan tumörceller med stamceller egenskaper kan berikas och i närvaro av epidermal tillväxtfaktorer (EGF) och fibroblast tillväxtfaktor (FGF), de kan odlas som enda cell-derived kolonier såsom NS kulturer. I detta selektiva kultur system dör mest särskiljande eller differentierade celler snabbt, medan stamceller delar och bildar de cellulära kluster. Detta tillåter generationen av en NS-kultur som upprätthåller gliom tumör funktioner16,17,18. Gliom NS kan användas för att utvärdera flera aspekter av tumörbiologi, inklusive analys av biomarkörer som har program i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Här, vi detalj ett protokoll att generera gliom NS och bädda in 3D kulturerna i paraffin som ska användas för IHC färgning. En fördel med fastställande och inbäddning gliom NS är att morfologi av NS bevaras bättre jämfört med den konventionella cytospin metod19, i vilka gliom NS utsätts för stressande manipulation för cell dissociation och bli tillplattad. Dessutom släcker inbäddning alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade tumör NS, aktivera färgning över fluorescerande spektra. Det övergripande målet med denna metod är att bevara 3D-strukturen för gliom celler genom en paraffin inbäddning process och aktivera karakterisering av gliom neurospheres med immunohistokemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel detalj vi en mångsidig och reproducerbar metod att utföra immunohistokemi på paraffin-inbäddat gliom NS, som upprätthåller den karakteristiska 3D-strukturen för tumörcellerna växer i den hjärnan i situ. Denna teknik har följande fördelar jämfört med celler pläterade på glas eller plast ytor: jag) bevarandet av 3D-strukturen för NS; (II) att undvika stress av cell dissociation före analys av proteinuttryck. (III) kylning av alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar & Stroke (NIH/NINDS) bidrag R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 till M.G.C.; NIH/NINDS beviljar R01-NS076991, R01-NS082311 och R01-NS096756 till P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Avdelningen för neurokirurgi; Leah’s Happy Hearts till M.G.C. och P.R.L.; och RNA biomedicin Grant F046166 till M.G.C. F.M.M. stöds av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. stöddes av ett Fulbright-argentinska ministeriet för idrott och utbildning gemenskap.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
