Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Methode ist es, die proteolytische Aktivität von komplexen biologischen Proben zu messen. Die Proben werden durch Molekulargewicht mit Elektrophorese durch eine Lösung von Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Diese Methode unterscheidet sich von traditionellen Gel Zymography, dass eine abgeschreckt Fluorogenic Peptid in der Lösung von Gel statt voller Länge Proteine, wie Gelatine oder Kasein kovalent eingearbeitet ist. Verwendung der Fluorogenic Peptide ermöglicht direkte Nachweis der proteolytischen Aktivität ohne zusätzliche Färbung Schritte. Enzyme in den biologischen Proben cleave das abgeschreckt Fluorogenic Peptid, was zu einem Anstieg in Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal in die Gele ist dann mit einem standard Leuchtstofflampen Gel Scanner abgebildet und quantifiziert mit Densitometrie. Die Verwendung von Peptiden als abbaubare Substrat erweitert erheblich die möglichen Proteasen nachweisbar mit Zymographic Techniken.

Einleitung

Gel Zymography ist ein biologischer Verfahren zur Messung der proteolytischen Aktivität in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten oder Zelle Nährmedien^1,2,3. Die Proben werden durch ihre Molmassen mit Elektrophorese durch ein Polyacrylamid-Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Gemeinsamen abbaubaren Substrate enthalten Gelatine, Kasein, Kollagen und Elastin, die verwendet wurden, um die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) -1,-2-3, -7,-8,-9 und-11, neben einer Vielzahl von Cathepsins^1,2

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösung von Gelschicht

1. Bereiten Sie eine 10 %-Polyacrylamid-Gel-Lösung gemäß Tabelle 1zu lösen. Fügen Sie die Tetramethylethylenediamine (TEMED) und Ammonium Bleichen (APS) unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.
2. Füllen Sie eine leere 1,5 mm Mini-Gel Kassette auf halbem Weg (5 mL) mit 10 % ige Lösung von Gel-Lösung.
3. Fügen Sie eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der Polyacrylamid-Gel zu produzieren eine Ebene Gel und Luftblasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreakti....

Ergebnisse

Mit der beschriebenen Methode hier, zwei fluoreszierende Protease-abbaubar Peptide flossen in Polyacrylamid-Gele: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (abgekürzt als QGIW in den Text und Zahlen) und GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (abgekürzt als LACW im gesamten Text und Zahlen). ↓ gibt die Site der Spaltung. QGIW ist ein Kollagen-ich abgeleitet Sequenz entwickelt, um zelluläre Collagenases¹⁴erkennen. LACW ist eine Sequenz, die für die Erkennung von MMP-14.......

Diskussion

Aktuelle Zymographic Techniken beruhen auf dem Einbau von nativen Substraten in Polyacrylamid-Gele für den Nachweis der Proteolyse. Während diese Techniken weit verbreiteten Einsatz angesammelt haben, werden sie noch in der Anzahl der Proteasen beschränkt, die Sie erkennen können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, in welche Leuchtstofflampen, Protease-abbaubar Peptide in der Polyacrylamid-Gel zu lösen integriert sind. Kovalente Kupplung mit ermöglicht ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül die Trennung und Nachweis .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mm leere Gelkassetten	ThermoFisher Scientific	NC2015
1,5 mm, 10 Well leere Gelkassettenkämme	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS-Lösung	Ambion	AM9820
3x Zymographie-Probenpuffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamid/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6-Well-Gewebekulturplatten	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Zentrifugalfiltereinheit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammouniumpersulfat	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimid-Kit	Klickchemie Werkzeuge	AZ107
Calciumchlorid	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethylsulfoxid	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Netzteil	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Injektionsnadeln	Fisher Scientific	14-826
Rundkolben (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Gummistopfen	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip-Tip-Spritze (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma-Hydrochlroid	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinkchlorid	Sigma-Aldrich

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