I Vitro analyser evaluere overføringen, invasjon og spredning av udødeliggjort menneskelige første trimester Trophoblast linjer
Summary
Her presenterer vi en svært tilgjengelig protokoll for å vurdere celle bevegelsen i menneskelig trophoblast celler ved hjelp av tre in vitro analyser: scratch analysen, transwell invasjon analysen og celle spredning analysen.
Abstract
Cellen bevegelse er en kritisk egenskap for trophoblasts under placental utvikling og tidlig i svangerskapet. Betydningen av riktig trophoblast overføring og invasjonen er demonstrert av graviditet lidelser som svangerskapsforgiftning og intrauterine vekst begrensning, som er forbundet med utilstrekkelig trophoblast invasjon av mors blodkar. Dessverre vår forståelse av mekanismer som morkaken utvikler seg fra overføring av trophoblasts er begrenset. In vitro analyser av celle migrasjon via scratch analysen er et nyttig verktøy i å identifisere faktorer som regulerer trophoblast trekkfugler kapasitet. Denne analysen alene definerer imidlertid ikke mobilnettet endringene kan føre til endrede celle migrasjon. Denne protokollen beskriver tre forskjellige in vitro analyser som brukes kollektivt å evaluere trophoblast celle bevegelse: scratch analysen, analysen invasjon og spredning analysen. Protokollene beskrevet her kan også endres for bruk i andre linjer å kvantifisere celle bevegelse i respons på stimuli. Disse metodene kan etterforskerne å identifisere individuelle faktorer som bidra til celle bevegelsen og gir en grundig undersøkelse av potensielle mekanismene bak tydelig endringer i celle migrasjon.
Introduction
Placental utvikling er et viktig skritt i etableringen av graviditet, påvirker både mors og fosterets helse. Imidlertid er mekanistisk grunnlaget som dette skjer ikke fullt ut forstått. Celle migrasjon er en viktig biologisk prosess som bidrar til etablering og funksjoner av morkaken under graviditeten. Etter blastocysten implantasjon skiller trophectoderm villous trophoblasts, som dekker overflaten av chorion villi, og er involvert i gass og næringsstoffer exchange, og extravillous trophoblasts (EVTs), som migrerer ut fra villi og invadere mors decidua og blodkar1. Migrering av EVTs er viktig for ombygging mors spiral arterier og etablere uteroplacental sirkulasjon for å støtte fetal vekst2. Utilstrekkelig trophoblast invasjon under graviditet resulterer i unormal placental utvikling og kan bidra til graviditet komplikasjoner som preeclampsia, svangerskapsdiabetes hypertensjon, intrauterin vekst begrensning og tidlig fødsel3, 4. Derfor er forstå faktorene som påvirker trophoblast motilitet avgjørende å bestemme veier kreves for vanlig placentation.
Trophoblast overføring styres av et kompleks nettverk av signalnettverk molekyler, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, hormoner og angiogenic faktorer5. På grunn av begrensningene av studere morkaken i vivo, in vitro analyser utnytte udødeliggjort menneskelige trophoblast celle linjene er avgjørende for å identifisere faktorer som bidrar til trophoblast motilitet. Bunnen og invasjonen analyser har vært brukt mye til kvantitativt vurdere rollen molekyler på trophoblast celle migrasjon6,7,8. Men mens nyttig i tandem å undersøke hvordan endringer i migrasjon kan forårsakes av endringer i celle invasiveness, høyde disse to analyser ikke for ytterligere mekanismer som kan bidra til endrede priser av celle migrasjon. For eksempel kan reduksjoner til frekvensen av celle spredning resultere i færre celler tilgjengelige for overføring.
Her beskriver vi kvantitative i vitro metoder for å vurdere trophoblast overføring ved hjelp av bunnen, celle spredning og celle invasjonen analyser. Et ensartet sår er opprettet i en celle monolayer i scratch analysen, og migrering av celler å fylle gapet er målt ved automatisert, time-lapse avbildning av såret og tetthet av celler i såret. Celle spredning analysen er basert på beregning av forholdet mellom cellene på hvert punkt i forhold til en kjent start antall celler. I celle invasjonen analysen, celler er seeded oppå en ekstracellulær matrix-belagt celle kultur sett inn kammer (f.eks Transwell) og antall celler som invaderer gjennom den ekstracellulære matrisen svar chemo-attractant telles.
Scratch analysen er et enkelt og effektivt verktøy som kan brukes til å bestemme hvordan ulike miljømessige forhold påvirker celle migrasjon. Spredning og invasjonen analyser kan senere brukes til å finne ut bidrag av celle spredning og invasiveness for generelle endringer i celle migrasjon. Samlet gir disse analyser robust målinger av biologiske prosesser som kan bidra til celle motilitet. To udødeliggjort første trimester trophoblast linjer ble brukt i beskrevet analyser, Swan.71 (Sw.71) og halv-st-8/SVneo9,10. Men kan disse analyser også være optimalisert for bruk i andre celletyper å identifisere viktige modulatorer av celle migrasjon og invasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne prosedyren bygger på bruk av migrasjon og invasjonen analyser med frekvensen av celle spredning som potensielle bidragsyter til målt forskjeller i trophoblast celle bevegelse. Brukes sammen, er disse in vitro analyser enkle og effektive metoder som kan brukes til å identifisere mobilnettet veier som regulerer trophoblast overføring. Som beskrevet ovenfor, kan trophoblast cellene behandles med hormoner, cytokiner, vekstfaktorer eller andre molekyler å avgjøre deres innvirkning på trophoblast bevegelse. Eventu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Gil Mor for å gi Sw.71 cellene. Denne forskningen ble støttet av en Albert McKern Scholar Award for S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
