通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与前体细胞的细胞表面标志物

摘要

本文介绍了一种结合了 体外 神经-内皮共培养系统及通过生物正交功能基团代谢整合唾液酸聚糖，用于扩增原代神经干细胞与祖细胞，并标记其表面唾液酸糖蛋白，以进行成像或质谱分析细胞表面标志物。

摘要

神经干细胞和祖细胞（NSPCs）是大脑复杂结构和功能的细胞基础，它们位于特化的微环境中。 体内 并可被分离和扩增 体外，可作为修复脑损伤的细胞移植重要资源。然而，由于缺乏特异性的细胞表面标志物，神经干细胞/祖细胞（NSPCs）具有异质性，在分子水平上尚未明确定义，也难以实现纯化。本方案此前已有报道，结合神经细胞-内皮细胞共培养体系与代谢性糖标记技术，用于鉴定原代NSPCs的表面唾液酸糖蛋白组。NSPC-内皮细胞共培养体系可支持原代NSPCs的自我更新与扩增 体外，从而获得足够数量的NSPCs。在培养的NSPCs中，使用带有生物正交功能基团的非天然唾液酸代谢探针标记唾液酸化糖链。通过比较在内皮细胞共培养条件下自我更新的NSPCs与正在分化的神经培养物中的唾液酸化糖蛋白组，我们鉴定出一组在NSPCs中富集的膜蛋白。具体而言，该方案包括：1）建立NSPC-内皮细胞共培养体系以及NSPC分化培养体系；2）使用叠氮糖N-叠氮乙酰甘露胺的全-O-乙酰化形式（Ac₄ManNAz）；3）在神经细胞培养物固定后，对修饰的唾液酸聚糖进行生物素偶联，用于成像，或从神经细胞培养物中提取蛋白质用于质谱分析。随后，通过比较扩增的NSPC与分化神经细胞培养物的质谱数据，筛选出富集于NSPC的表面标志物候选分子。该方案对起始材料中低丰度膜蛋白的鉴定具有高度敏感性，经适当修改后，亦可应用于其他系统中的标志物发现。

引言

神经干细胞被定义为一类具有多向分化潜能的细胞群体，能够通过自我更新维持干细胞库，并分化为神经元和胶质细胞。它们是神经系统中的主要 细胞类型，在再生医学中可能具有重要的治疗潜力，例如通过细胞移植方式将其植入病变或受损的大脑组织中^1,2。随着发育进程的推进，神经干细胞群体逐渐变得异质化^3,4，且大脑中神经干细胞的比例逐步下降⁵。一般来说，胚胎期神经干细胞及其他神经前体细胞统称为神经干细胞和前体细胞（NSPCs），在小鼠中主要位于生发区，即脑室区和脑室下区⁶。在胚胎大脑中，神经干细胞可直接或通过中间前体细胞（IPCs）间接产生神经元，在某些物种中还可通过外侧脑室下区前体细胞（oRGs）生成神经元^7,8。每种亚型在脑器官发生及临床应用中的作用，取决于其特定的分子特征、形态结构、在干细胞微环境中的位置以及分化潜能⁹。然而，目前可用的细胞表面标志物尚无法明确区分和纯化不同亚型的NSPCs，这限制了对这些亚型的理解与应用。

方案

​本研究中使用的所有动物实验方案均经清华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照IACUC的指南进行操作。清华大学实验动物设施已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的认证。胚胎发育阶段的确定以检测到阴道栓当天中午为胚胎发育0.5天（E0.5）进行计算。

注意：所有细胞均在细胞培养箱中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下进行培养。

1. 在可渗透支持性插件中制备小鼠内皮细胞培养

注意：BEND3 细胞根据制造商说明书进行培养。

1. 在500 mL DMEM中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素溶液，混匀，配制BEND3细胞培养基（BM）。
2. 吸除培养皿中的培养基，用1 mL PBS洗涤BEND3细胞培养物一次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育4分钟。
3. 向细胞中加入1 mL BM以中和胰蛋白酶-EDTA，轻轻吹打数次使细胞完全解离。将细胞悬液转移至新的15 mL锥形离心管中，在室温（RT）下以400 ×g离心5分钟，收集细胞沉淀。
4. 吸除上清液，用9 mL新鲜BM重悬细胞，取1 mL细胞悬液加入....

结果

体外扩增和代谢标记原代胚胎神经干细胞前体细胞（NSPCs）的整个过程需要6天（图1A）。BEND3细胞系的质量以及新分离的原代NSPCs的状态是实验成功的关键。BEND3细胞可分泌可溶性因子，促进NSPCs的自我更新和增殖。在与神经细胞共培养前，必须确保BEND3细胞无任何污染，细胞分裂活跃且死亡率极低。原代NSPCs的制备需谨慎操作，以避免在解离过程中造成过度损伤。受损的NSPCs可能仍能生长和分化，但其对内皮刺激的响应能力下降，难以维持干性并有效扩增。细胞培养过程中应格外注意无菌操作，因为本方案未建议在原代培养基中添加抗生素。

成功的内皮细胞共培养将诱导神经干细胞/前体细胞（NSPCs）形成较大、片状的克隆。此类特征性的克隆形态在第4天开始明显，并在第6天时尤为典型。在克隆内部，细胞之间保持紧密接触。使用针对NSPC标志物Nestin和神经元标志物β-tubulin III的抗体进行免疫染.......

讨论

表面标志物常用于在体外和体内标记并纯化特定类型的细胞^17,18。表面标志物的发现极大地推动了再生医学和干细胞研究的发展，因其提供了分子工具，可从正常或病变组织及培养皿中选择性富集干细胞群体，从而为临床应用或生物学特性研究提供纯化的细胞资源。然而，由于难以从原代组织中分离干细胞，神经干细胞研究中表面标志物的开发进展较为缓慢。本文所述方案基于一种简化的体外平台。通过比较内皮细胞共培养扩增的原代NSPCs与正在分化的神经培养物，可突出显示在扩增NSPCs中差异表达的蛋白质，进而实现进一步鉴定。本方案还提供了一种通过劫持细胞内在代谢途径，利用生物正交基团标记唾液酸聚糖来纯化细胞表面蛋白的替代策略。与传统的细胞表面蛋白纯化方案相比，本方案的优势体现在两个特定方面：1）细胞表面蛋白上唾液酸化的广泛存在确保了对细胞表面蛋白质组的最大覆盖；2） 生物正交基团与其配体之间的反应特异性保证了所获得表面蛋白质组的纯度。因此，在起始材料较少的情况下，本方案可实现更灵敏的蛋白质组学分析。我们已在原代NSPCs表面标志物的研究中验证了该方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081	1%
丙酮酸钠	Sigma	P5280	1%
N2 添加剂	Gibco	17502048	1:100
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A7250	1 mM
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 添加剂	Gibco	17504044	1:50
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
碱性成纤维细胞生长因子	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	1%
胎牛血清	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
多聚甲醛	Sigma	158127	4%
蔗糖	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA 裂解缓冲液	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE 上样缓冲液 2x	Solarbio	P1018
6 孔板	Corning	3335
Tris-甘氨酸蛋白凝胶	invitrogen	xp00100box
小鼠单克隆抗 Nestin 抗体	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1:20
小鼠单克隆抗 β-微管蛋白 III 抗体	Sigma	T8860	1:1,000
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG1	invitrogen	A-21121	1:1,000
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠 IgG2b	invitrogen	A-21143	1:1,000
牛血清白蛋白 V	Amresco	0332
吐温 X-100	Amresco	0694
BCA 检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
二甲基亚砜	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
炔基-生物素	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	实验室合成
抗坏血酸钠	Sigma	A4034
甲醇	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Fluor 647 标记的链霉亲和素	invitrogen	S21374	1:1,000
三乙醇胺	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 链霉亲和素	invitrogen	60210
碳酸氢铵	Sigma	9830
考马斯亮蓝 R-250	Thermo Scientific	20278
异氟烷	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
尿素	Sigma	U5378