Der er blevet beskrevet en detaljeret protokol for rensning og efterfølgende analyse af et monoklonalt antistof fra den høstede cellekultur væske (HCCF) af automatiserede mikrobioreaktorer. Brug af Analytics til at bestemme kritiske kvalitets attributter (CQAs) og maksimering af begrænset prøvevolumen til at udtrække vitale oplysninger er også præsenteret.
Monoklonale antistoffer (mAbs) er en af de mest populære og velkarakteriserede biologiske produkter fremstillet i dag. Mest almindeligt produceret ved hjælp af kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, kultur og procesbetingelser skal optimeres for at maksimere antistof titre og opnå mål kvalitet profiler. Denne optimering bruger typisk automatiserede mikroskala bioreaktorer (15 mL) til at screene flere procesbetingelser parallelt. Optimerings kriterier omfatter kultur præstationer og de kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) for det monoklonale antistof (mAb), som kan påvirke dets virkning og sikkerhed. Målinger af kultur præstationer omfatter cellevækst og næringsstof forbrug, mens CQAs omfatter MABS N-glykosylering og aggregerings profiler, opladnings varianter og molekylvægt. Denne detaljerede protokol beskriver, hvordan man renser og efterfølgende analyserer HCCF-prøver, der produceres af et automatiseret mikrobioreaktor system, for at opnå værdifulde præstationsmålinger og output. For det første anvendes et automatiseret protein en hurtig proteinvæske kromatografi (FPLC) metode til at rense mAb fra høstede cellekultur prøver. Når de er koncentreret, analyseres Les profilerne ved massespektrometri ved hjælp af en specifik platform (Se tabellen over materialer). Antistof molekylvægte og aggregerings profiler bestemmes ved hjælp af størrelses udelukkelses kromatografi-multipel vinkel lysspredning (SEC-Mik), mens opladnings varianterne analyseres ved hjælp af mikrochip kapillar zone elektroforese (mCZE). Ud over de kultur præstationsmålinger, der er taget under bioreaktor processen (dvs. kultur levedygtighed, celletal og almindeligt forekommende metabolitter, herunder glutamin, glucose, laktat og ammoniak), analyseres brugte medier for at identificere begrænsende næringsstoffer til forbedre fodrings strategierne og det overordnede proces design. Derfor beskrives også en detaljeret protokol for den absolutte kvantificering af aminosyrer ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) af brugte medier. De metoder, der anvendes i denne protokol, udnytter platforme med høj dataoverførselshastighed, der er kompatible med et stort antal småprøver.
Protein Therapeutics bruges til at behandle et voksende udvalg af medicinske tilstande, herunder vævstransplantation komplikationer, autoimmune lidelser, og kræftformer1. Siden 2004, USA Food and Drug Administration (USFDA) har dokumenteret en stigende andel af biologiske licensansøgninger (Blas) af alle godkendelser reguleret af Center for Drug evaluering og forskning (CDer), med BLAs tegner sig for over 25% i 2014 og 20152.
I betragtning af dette ekspanderende marked, biofarmaceutiske producenter udfordres med hurtigt at levere mere produkt med ensartet kvalitet. Bestræbelserne på at øge produktudbyttet har fokuseret på CHO Cell Engineering og produktionslinje screening, selv om de mest markante forbedringer skyldes fremskridt i Media/feed strategi optimering og cellekultur miljøkontrol1, 3 , 4 , 5 under fremstillingsprocessen.
Da mAbs produceres i et biologisk system, kan der være iboende protein variabilitet. Antistof sammensætning kan ændres post-translationelt, såsom glykosylering eller påvirket af nedbrydning eller enzymatiske reaktioner. Disse strukturelle variationer kan fremkalde farlige immunreaktioner eller ændre antistof binding, hvilket igen kan reducere eller eliminere den tilsigtede terapeutiske funktion5. Således er kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) af monoklonale antistoffer-N-glycan profil, charge variant distribution, og procentdelen af antistof i monomerisk form-regelmæssigt overvåget og kontrolleret som en del af en kvalitet af design (QbD) tilgang under fremstillingsprocesser1,6. I et reguleret produktionsmiljø skal terapeutiske proteiner opfylde godkendelseskriterier, der skal gives i licens som et godkendt kommercielt lægemiddel7. De metoder, der præsenteres heri vil typisk være en del af kvaliteten karakterisering proces for et antistof7,8, og enhver protein forsker vil være fortrolig med deres brug.
I tidligere arbejde9er anvendelse og drift af mikrobioreaktorer til høj gennemløbs screening af celle dyrkningsbetingelser i opstrøms bioprocessing blevet beskrevet. Det rensede produkt, der er fremstillet af de varierende medie forhold, underkastes N-glycan-analyse ved hjælp af LC-MS. Glykosylations mønstre af terapeutiske proteiner kan påvises og karakteriseres ved hjælp af LC-MS-teknikker10,11og tilstedeværelsen af forskellige Les arter er blevet knyttet til bioprocess parametre såsom foder strategi, ph, og temperatur12. Virkningen af de varierende medie forhold på produkternes kvalitet, angivet med procentdelen af den resulterende IgG i monomerisk form, evalueres også med størrelses ekskluderende kromatografi-multi-Angle lysspredning (SEC-Mik)13,14 , 15. den Charge variant profil repræsenterer en række ændringer16 , der kan påvirke funktionen af et produkt. Mikrokapillar zone elektroforese (mCZE) er en teknik, der giver en betydeligt hurtigere analyse tid i forhold til traditionel kation udveksling (CEX) kromatografi og kapillar isoelektrisk fokusering (cIEF) metoder, der anvendes til opladning variant analyse17 ,18. Brugt bioreaktor medier blev analyseret for at spore aminosyre forbrug under protein produktion, da det vedrører ændringer i antistof identifikation attributter19,20,21,22 , 23.
Protein analyse giver os mulighed for at identificere kritiske procesparametre (Cpp’er) baseret på relationerne mellem proces input og ændringer i CQAs. Under bioprocess udvikling, identificere og måle Cpp’er fundamentalt viser proceskontrol og sikrer, at produktet ikke har ændret sig, hvilket er afgørende i stærkt regulerede produktionsmiljøer. I dette dokument præsenteres analytiske teknikker til måling af nogle af de biokemiske egenskaber ved det protein, der er mest relevant for produkt-CQAs (N-glycan profil, opladnings varianter og størrelses homogenitet).
HCCF indeholder snavs og store partikler, der kan tilstoppe og ødelægge dyre instrumentering, og derfor er kultur afklaring nødvendig før yderligere downstream-behandling. Centrifugering er generelt den første fremgangsmåde til at adskille celler og andre uopløselige partikler fra proteiner efterfulgt af filtration. Denne filtrerede HCCF udsættes derefter for hurtig Proteinvæske kromatografi (FPLC) til rensning. Rensning af HCCF fra automatiserede mikrobioreaktorer for at opnå produktet er et vigtigt skridt i efterfølgende forarbejdning. Her anvendes et stationære fplc-system med et protein a-søjle til at opnå monoklonale antistoffer fra hccf. Analytics til upstream-processer kan give nyttig indsigt i cellernes adfærd og vejlede bioprocess design, hvilket hjælper med at opnå et konsistent og pålideligt kvalitetsprodukt. Analytics giver os også mulighed for at linke kritiske kvalitets attributter (CQAs) til upstream-og downstream-processer. Præsenteret her er fire assays, der er almindeligt anvendt i karakteriseringen af monoklonale antistoffer. Disse teknikker er robuste, pålidelige og let deployerbare til proces-og produktanalyse fra en række opstrøms kilder, som kun er delvist renset og stadig kan indeholde restniveauer af DNA og HCP.
Ved oprydning af prøver til analyse skal der findes en vigtig balance mellem at lave en prøve, som er tilstrækkelig ren til analyse, samtidig med at variabiliteten i bioreaktoren bevares. De to mest almindeligt forurenende kontaminerende produkter er DNA og HCP, som kan kontrolleres ved at måle forholdet absorbans ved 260/280 Nm og gennem SDS-PAGE eller μCE-SDS. De analyser, der præsenteres her, er ikke følsomme over for lave niveauer af DNA-indhold. Produktets renhed er > 95% ren, som bestemt af μCE-SDS.
Beregning af opladnings varianten med et mikrokapillær elektroforese system giver en høj dataoverførselsmetode til at identificere opladnings varianter, med chips og reagenser, der er relativt nemme at implementere. Karakteren af teknikken og kemien i mærknings reagenset er både følsom over for hjælpestoffer og andre primære aminer, hvilket kræver et afsaltningtrin for de fleste prøve matrixer. Fra erfaring, lave niveauer af DNA Co-migrere med Free-Dye fra mærkningen reaktion og ikke påvirker kvaliteten af resultaterne. Mens variabiliteten af grund-, hoved-og sure topkvantificering typisk er < 1%, kan højere niveauer af DNA og andre forurenende stoffer øge variabiliteten af analysen. Det er ekstremt vigtigt at være i overensstemmelse med protein mærkning og sikre hurtig brug af DMF efter fjernelse fra flasken og blandes med farvestoffet. Lysin og/eller histidin standarder anbefales som mærknings kontrol. Over tid og afhængigt af prøve kvaliteten kan spåner foul eller miste belægningen på mikrofluidics kanaler, hvilket fører til større støj, tilstedeværelsen af spøgelses toppe og større prøve-til-prøve variation. For at identificere denne forekomst blev blanks og en system egnetheds standard (dvs. NISTmAb) samtidig analyseret med prøverne med jævne mellemrum. Når chip problemer opstår, kan chips vaskes med opbevaringsløsningen eller udskiftes.
De metoder, der anvendes til Les-analyse af terapeutiske glykoproteiner, involverer primært væskekromatografi (LC) og/eller massespektrometri (MS), hvor lektin-mikroarray analysen vinder popularitet som en tredje løsningsmodel25. Den metode, der er beskrevet i dette papir, bruger både LC og MS, som har fordele og ulemper. Massespektrometriske metoder har fordelen ved masse verifikation af de analyserede glycaner, hvilket ikke er muligt med LC-baserede metoder ved hjælp af en fluorescerende detekteringsudgang eller lektin-mikroarrays. Denne metode bruger LC-og fluorescens registrering til at tildele Les-identiteter ved hjælp af opbevaringstiden sammenligning med en dextran Ladder-standard. Fluorescens overvågning giver mulighed for øget følsomhed og kvantificering på grund af den lethed af dens påvisning, hvor MS alene måske ikke være i stand til at kvantificere lav overflod arter på grund af den dårlige ionisering effektivitet oligosaccharider. Masse oplysningerne fra MS bruges til at bekræfte Les-identiteter, men behandlingssoftwaren bruger ikke masse oplysninger som de primære tildelingskriterier. Derfor, uden reproducerbar kromatografi og let opløse toppe, denne metode kan lide med hensyn Les tildelinger. Heldigvis kan masse informationen hjælpe med Les-tildelinger, selv i situationer, hvor kromatografien er subpar, såsom forskydninger i retentionstiden, der hindrer reproducerbare Les tildelinger. Hvis denne metode anvendes uden MS, skal kromatografien være på højeste niveau, da masse oplysninger ikke kan bruges til at korrigere for tidsforskydningen i opholdstiden.
Den aminosyre analysemetode, der er beskrevet her, udnytter LC-MS til hurtig kvantitation af underivatiserede aminosyrer i rå cellekultur medier. Alternative aminosyre analysemetoder kræver aminosyre forædling agenter for at muliggøre UV-detektion26. LC-MS-metoden giver vigtige fordele i forhold til LC-UV-metoden: det giver mulighed for identifikation baseret på både retentionstiden og ionmassen i modsætning til LC-UV-metoden, som er begrænset af en mangel på masse karakterisering. Desuden giver LC-MS-metoden tid og reproducerbarheds fordele, da LC-UV-metoden kræver en tidskrævende forædling-reaktion, som kan give prøve variabilitet27. Men, injektion af rå cellekultur medier i LC-MS metode kan forårsage skadelige virkninger på MS signal på grund af ion skimmer fouling. En kalibrerings stige injiceres hyppigt som et system egnethedskontrol, og prøverække følge er randomiseret til at forhindre bias i dataene.
Cellekultur processen for antistof produktion ved hjælp af mikrobioreaktorer er tidligere beskrevet9. I denne undersøgelse, detaljerede protokoller for monoklonale antistof karakterisering metoder, der maksimerer data erhvervet fra begrænset prøvevolumener er veldefinerede. Begrænsede mængder af høstet cellekultur Fluid kan undertiden begrænse de erhvervede produktoplysninger og udvælgelse af de rigtige analytiske procedurer for at opnå produktkvalitet data er afgørende. Analytics er vigtigt for at sammenkæde upstream-procesparametrene med ændringerne i produktkvaliteten. Her gives der en retningslinje, så brugerne har ret til at karakterisere mAbs, når de arbejder med mikrobioreaktorer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Scott Lute for den analytiske støtte, han ydede. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbejde leveres af CDER critical path-programmet (CA #1-13). Dette projekt er delvist understøttet af en udnævnelse til praktik-/forsknings deltagelses programmet på kontoret for bioteknologiske produkter, U.S. Food and Drug Administration, administreret af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en Interagency aftale mellem det amerikanske energiministerium og FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |