Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

Resumo

Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.

Resumo

A rica incidência de quinase 2 (LRRK2) é o gene mais frequentemente mutado na doença hereditária de Parkinson (DP) e todas as mutações lRRK2 patogênicas resultam na hiperativação de sua função quinase. Aqui, descrevemos um ensaio fácil e robusto para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em neutrófilos de sangue periférico sénior humano medindo a fosforilação controlada por LRRK2 de um de seus substratos fisiológicos, Rab10 at threonine 73. A análise imunoblotting descrita requer um anticorpo totalmente seletivo e fosforespecífico que reconhece o rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como o anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10. Ele usa neutrófilos de sangue periféricos humanos, porque o sangue periférico é facilmente acessível e os neutrófilos são um constituinte abundante e homogêneo. É importante ressaltar que os neutrófilos expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10. Uma desvantagem potencial dos neutrófilos é sua alta atividade protease serinica intrínseca, que requer o uso de inibidores de protease muito potentes, como o organophosphorus neurotoxin diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte do tampão de lise. No entanto, os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa sobre a atividade da via de quinase LRRK2 in vivo e devem ser considerados para inclusão em coleções biorepositórias de DP.

Introdução

As tentativas de retardar ou parar a doença de Parkinson (DP) falharam até agora. A descoberta de mutações hiperativanas na rica incidência repetição quinase 2 (LRRK2) que causam e/ou aumentam o risco de DP levou ao desenvolvimento de inibidores de quinase LRRK2^1,2,3. Estes já entraram em ensaios clínicos⁴. A função exata do LRRK2 não é clara, mas um grande avanço tem sido a identificação de um subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluindo Rab10, como os primeiros substratos fisiológicos de boa fé da quinase LRRK2^5,<....

Protocolo

De acordo com a regulamentação local do Reino Unido, todas as manipulações e pipetting de sangue humano são realizadas em um gabinete de segurança biológica de categoria 2. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o conselho de ética local e todos os participantes forneceram consentimento informado.

1. Preparação

1. Prepare 0,1 mL de EDTA Stock Solution 1 contendo EDTA de 100 mM em solução salina tamponada por fosfato (PBS).
2. Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 contendo 1 mM EDTA em PBS.
3. Prepare o tampão de lyse contendo 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na

Resultados

Nosso ensaio permite interrogar a ativação da quinase LRRK2 associada ao PD em neutrófilos de sangue periférico humano com a fosforilação Rab10 dependente de LRRK2 como leitura. Os neutrófilos são uma população homogênea e abundante de glóbulos brancos periféricos que expressa altos níveis tanto das proteínas LRRK2 quanto Rab10(Figura 1). A única outra população celular entre as células mononucleares periféricas remanescentes (PBMCs) com alto número de cópias de ambas as proteínas são monóci.......

Discussão

Evidências clínicas, genéticas e bioquímicas convincentes apontam para um papel importante para o LRRK2 e, em particular, sua função quinase na doença de Parkinson⁷. Os inibidores da quinase LRRK2 foram desenvolvidos e estão entrando em ensaios clínicos^2,4,12. Como tal, há a necessidade de explorar o LRRK2 como um biomarcador para o engajamento do alvo, bem como a estratificação do paciente. Nosso protoco.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ponteiras de pipeta de 1 mL	Sarstedt	70.762	ou equivalente
1,5 mL Micro tubos	Sarstedt	72.690.001	ou equivalente
10 mL Ponteiras de pipeta	Sarstedt	86.1254.025	ou equivalente
10 μ L Pontas de pipeta	Sarstedt	70.113	ou equivalente
15 mL tubo de falcão	Cellstar	188 271	ou equivalente
200 μ L Ponteiras de pipeta	Sarstedt	70.760.002	ou equivalente
25 mL Ponteiras de pipeta	Sarstedt	86.1685.001	ou equivalente
50 mL tubo de falcão	Cellstar	227 261	ou equivalente
BD Vacutainer Hemogard Fechamento Plástico K2-EDTA Tubo	BD	BD 367525	ou
equivalente Beckman Coulter Allegra X-15R centrífuga	Beckman		ou centrífuga equivalente com rotador de balde de natação para tubos de falcão de 15 mL e 50 mL na velocidade 1000-1200 x g
Cabine de segurança biológica categoria 2.
coquetel de inibidor de protease completo (sem EDTA)	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropilfluorofosfato)	Sigma	D0879	Prepare solução estoque 0.5M em isopropanol usando precauções especiais
Dimetilsulfóxido	Sigma	6250
Gelo seco ou nitrogênio
Dulbecco's solução salina tamponada com fosfato	ThermoFisher	14190094	ou equivalente
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	para segurar 1 tubo cônico de 50ml
Kit de Isolamento Direto de Neutrófilos Humanos EasySep	Célula-tronco	19666	Isso contém soluções chamadas " Coquetel de isolamento" e " Centrífuga Eppendorf
EGTA	Sigma	E3889
Centrífuga Eppendorf RapidSpheres 5417R	Eppendorf
Etanol, em frasco
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (grau anidro)	Tampão de	Sigma 278475
(50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v / v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM de β-glicerofosfato, 5 mM de pirofosfato de sódio, 0,27 M de sacarose, 0,1% (v / v) de β-mercaptoetanol, 1x coquetel de inibidor de protease completo (sem EDTA) (Roche), 1 μ g/ml de microcistina-LR, 0,5 mM de diisopropilfluorofosfato (DIFP).			alternativamente tampão de lise congelado em alíquotas sem Microcistina-LR, DIFP disponível a partir de Reagentes MRC-PPU (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inibidor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	ou equivalente (inibidor LRRK2 potente e seletivo
Microcistina-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml estoque em DMSO e armazene a -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Caneta
Equipamento
RPMI 1640 Médio	ThermoFisher	21875034	ou
pirofosfato de sódio	Sigma	S22
sacarose	Sigma	S0389
β-glicerofosfato	Sigma	50020
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148
Anticorpos sugeridos para Western blotting
Anticorpo anti-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-&alfa;-tubulina	Cell Signaling Technologies	5174	usado na diluição 1:2000
Cabra anti-rato IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	usado na diluição 1:10.000
Cabra anti-rato IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	usado na diluição 1:10.000
Cabra anti-coelho IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	usado a 1:10.000 diluição
MJFF-total Rab10 anticorpo de camundongo	gerado por nanoTools (nanotools.de)	não aplicável*	usado em 2 μ g/ml de concentração final; * O anticorpo Rab10 total MJFF gerado por nanoTools (www.nanotools.de) [11] será comercializado pela Fundação Michael J Fox em 2018
Anticorpos anticorpo anti-LRRK2 C-terminal	de camundongo Anticorpos Incorporados	75-253	usado em 1 μ g/ml concentração final
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagentes e Serviços	UDD2	usado a 1 μ g/ml de concentração final

líquidode spray lise )de marcação permanentede proteção pessoal equivalente