Her, beskriver vi en strategi for effektiv og reproducerbar til at producere, titer og kvalitetskontrol partier af adeno-associeret virus vektorer. Det giver brugeren mulighed for opnå en vektor forberedelse med høj titer (≥ 1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høj renhed, klar til in vitro- brug eller i vivo .
Gen leveringsværktøjer baseret på adeno-associeret virus (AAVs) er et populært valg for levering af transgener til centralnervesystemet (CNS), herunder gen terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan inficere både delende og ikke-dividere celler og yde langsigtet transgen udtryk. Vigtigere, nogle serotyper, som den nyligt beskrevne PHP. B, kan krydse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, efter systemisk levering. AAV vektorer kan fremstilles effektivt i laboratoriet. Robust og reproducerbare protokoller er dog forpligtet til at indhente AAV vektorer med tilstrækkelig renhed niveauer og titer værdier højt nok til i vivo applikationer. Denne protokol beskriver en effektiv og reproducerbare strategi for AAV vektor produktion, baseret på en iodixanol gradient rensning strategi. Metoden iodixanol rensning er velegnede til at opnå partier af høj-titer AAV vektorer af høj renhed, sammenlignet med andre metoder, rensning. Protokollen er desuden generelt hurtigere end andre i øjeblikket beskrevne metoder. Derudover en kvantitativ polymerase kæde reaktion (qPCR)-baseret strategi er beskrevet for en hurtig og præcis bestemmelse af vektor titer, samt en sølvfarvning metode til at bestemme renheden af vektor batch. Endelig, repræsentative resultater af genet levering til CNS, efter systemisk indgift af AAV-PHP. B, præsenteres. Sådanne resultater bør være muligt i alle laboratorier ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i denne artikel.
I de sidste 30 år, er wild-type AAVs blevet manipuleret til at oprette rekombinant AAV vektorer, som har vist sig for at være usædvanligt nyttige værktøjer til genoverførsel i CNS1,2,3,4, 5,6 og gen terapi tilgange til sygdom (herunder godkendt af FDA og EMA terapier)4,7. Deres egnethed til brug i CNS stammer i vid udstrækning fra deres evne til at inficere ikke dividere, post mitotiske celler, der typisk findes i CNS8. Men AAV-baserede vektorer har også fordelen, at en langsigtet udtryk for enhver given terapeutiske transgen4,9 mens fremkalde en mildere immunrespons i forhold til andre virale vektorer7, 8,10,11,12.
De vigtigste elementer i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Wild-type AAVs er enkeltstrenget (ss) DNA virus med en genom ca 5 kilobases (kb)13. For produktion af rekombinant AAV vektorer, rep og cap gener (nødvendigt for genom replikering og samling af viral kapsid) er slettet fra genomet af vildtype AAV og leveres i trans, forlader plads til en udtrykket kassette indeholdende transgen14,15. De inverted terminal gentagne sekvenser (ITRs) af den oprindelige virale genom er de eneste opbevarede elementer i en AAV vektor, da disse er afgørende for replikation og pakning3,10,14. AAV vektorer kan være udviklet til at forbedre transgen udtryk; en mutation i et af ITRs fører til dannelsen af en hårnål loop, der effektivt gør det muligt for generation af en supplerende DNA strand3,7,15. Den største fordel ved denne konfiguration, kaldes en selv-supplerende (sc) genom, er, at det omgår behovet for anden-strand syntese typisk i AAVs, betydeligt øge hastighed og niveauer af transgenet udtryk konventionelle livscyklus 1. ikke desto mindre, ved hjælp af en scAAV genom reducerer lasteevne vektorens til ca. 2,4 kb. Dette omfatter transgen sekvenser, samt eventuelle lovgivningsmæssige sekvenser som projektledere eller mikroRNA-bindingssteder, at begrænse udtryk til specifikke celle typer16.
AAV kapsid bestemmer vektor-vært celle interaktion og giver en grad af celle type eller væv tropisme for en AAV serotype, som også kan udnyttes til at begrænse transgen udtryk til bestemte steder. Flere AAV serotyper findes i naturen, mens andre har været produceret i laboratorier gennem rekombinant fremgangsmåder (dvs. PHP. B). Derudover nogle capsids også skænke andre nyttige egenskaber, såsom evne til at krydse BBB, resulterer i levering af transgener i hele CNS efter systemisk indgift. Dette har vist sig for AAV9 og for nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som følge heraf disse serotyper viser sig for at være særlig relevant for nye gen terapi tilgange for neurodegenerative lidelser1,17,18.
Formålet med denne protokol er at beskrive en omkostningseffektiv metode til mindre produktion af AAV vektorer med høj titer og renhed. Selvom resultaterne præsenteres her bruge PHP. B kapsid og et scAAV udtryk kassette, protokollen er egnet til fremstilling af flere AAV vektor serotyper og genom konfigurationer, hvilket giver maksimal eksperimentelle fleksibilitet. Dog kan vektor udbytte og endelige renhed variere afhængigt af den valgte serotype.
Selve protokollen er en variant af metoden klassisk tri-Transfektion for viral vektor produktion og omfatter brug af en iodixanol gradient vektor oprydning, som i forhold til den klassiske brug af cæsium chlorid (CsCl) forløb, har været rapporteret for at producere AAV vektorer af højere renhed i et mere tid-effektive måde19,20,21.
Trinene Transfektion, rensning og koncentration er beregnet til at udføres efter god laboratoriepraksis (GLP) i en vævskultur laboratorium normeret til viral vektor arbejde. Hver opgave skal udføres i overensstemmelse med de relevante lokale og nationale lovgivning vedrørende viral vektor produktion og brug. Arbejde skal udføres under en laminar flow hætte og i sterile forhold. Inde i funktionen vektor anbefales det at bære en lab forklæde, ud over den regelmæssige vævskultur laboratoriekittel. Desuden bør et dobbelt par handsker samt plast overtrækssko, blive båret på alle tidspunkter.
Før start vektor produktion, sikre alt nødvendigt udstyr og plasmider er tilgængelige. 1) pCapsid plasmid indeholder rep genet, der koder fire nonstrukturelle proteiner nødvendige for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og fælles landbrugspolitik gen, der koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmid indeholder gener E4, E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produktion i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmid indeholder transgen udtryk kassette, flankeret af to ITRs. Disse plasmider kan være syntese de novo i laboratoriet ved hjælp af sekvenser tilgængelige online22. For plasmider gjort de novo, er især dem der indeholder roman transgener, sekventering påkrævet, for at sikre, at de transgene og ITRs er korrekte. Alternativt, premade plasmider kan erhverves direkte igennem online plasmid repositories. Når det er nødvendigt, plasmider kan forstærkes og renset ved hjælp af standard kits, ifølge producentens instruktioner23.
Vektor titer og renhed kan påvirke transduktion evne til vektor. Supplerende protokoller leveres for at vurdere kvaliteten af den producerede vektor. De endelige vektorer vil være nyttig for studier af CNS cellefunktion i både in vitro- og i vivo applikationer.
Produktionen af rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruger materialer og udstyr, der er fælles for de fleste molekylærbiologiske laboratorier og celle kultur faciliteter. Det tillader brugeren at få ren, prækliniske grade AAV vektorer, der kan bruges til at målrette flere celle og væv typer på tværs af en vifte af in vitro- og i vivo applikationer. En af de største fordele af denne protokol, i forhold til andre (dvs. CsCl-baserede rensning), er kortere arbejdstid behov. Klar-til-brug AAV vektorer er opnåelige i højst 6 arbejdsdage efter den indledende Transfektion af HEK293T celler.
Flere faktorer kan negativt påvirke det endelige udbytte eller kvaliteten af AAV vektor. Dårlig Transfektion effektivitet er en af hovedårsagerne til en lav viral udbytte33. En stor anbefaling er brugen af HEK293T celler, der ikke har været passaged mere end 20 gange og har ikke en celle sammenløbet større end 90% på tidspunktet for Transfektion21. Derudover har Transfektion valgte metode stor indflydelse på resultaterne. Denne protokol er baseret på anvendelse af PEI. PEI er en kationiske polymer med evnen til at levere eksogene DNA til cellekernen gennem generation af komplekser af polymer og nukleinsyre, kendt som polyplexes, som er overtaget af celle og trafikerede via endosomes34. PEI-baserede Transfektion er nemt og hurtigt at udføre, i modsætning til andre almindeligt anvendte metoder, såsom DNA udfældes sammen med calcium fosfat35. PEI-baserede Transfektion er også meget billigere i forhold til andre nyindførte metoder, såsom brugen af kationiske lipider og magnet-medieret Transfektion36.
Rensning strategi spiller en nøglerolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserede purifications har tendens til at indeholde en højere procentdel af Tom viruspartikler (20%)20. Dette opvejes til en vis grad af den omstændighed, at iodixanol-baserede rensning rutinemæssigt resulterer i AAV vektor præparater med en partikel til smitteevne ratio på mindre end 100. Dette udgør en betydelig forbedring i forhold til konventionelle CsCl-baserede procedurer, som er betydeligt tab af partikel smitteevne rapporteret37. En anden fælles alternativ metode til at rense AAV vektorer er kromatografi-baserede rensning. Denne metode har dog den store ulempe, at en bestemt kolonne er påkrævet for hver vektor kapsid bruges: for eksempel, mens AAV2 er klassisk isoleret ved hjælp af heparin kolonner, denne metode virker ikke med AAV4 og AAV5, som ikke besidder heparin-binding Steder på deres capsids38. I betragtning af at kromatografi rensning er også dyrt, er iodixanol-baserede rensning generelt mere egnet til laboratorier, der ønsker at producere høj kvalitet partier af AAV vektorer på en lille skala33,39, 40. for at maksimere det endelige udbytte og renhed af vektoren, extreme care er dog nødvendigt når du foretager iodixanol forløb. De forskellige iodixanol fraktioner skal overføres til ultracentrifugering røret ved hjælp af en steril Pasteur pipette hvis spids er rørende mur af røret: iodixanol bør bortvises fra pipetten, langsomt og konstant. Som vektor partikler ophobes i 40% iodixanol lag, skal pleje tages for at sikre, at grænsefladerne gradient ikke blander20. Endelig, den brøkdel, som indeholder vektoren bør inddrives ved indsættelse af en rustfrit stål stump nål med en måler ikke større end 20 G. For at maksimere vektor opsving, skal den klare fraktion hentes i sin helhed. Under dette trin er timing afgørende. For at undgå at gå på kompromis med renheden af forberedelsen, er det vigtigt at stoppe samlingen, før andre (kontaminerende) faser af forløbet er indsamlet.
Forskelle i den fremkomne vektor titer kan tilskrives også vektoren iboende evne til at producere emballerede partikler. En sammenligning mellem forskellige AAV serotyper viste, at nogle AAV vektorerne er sværere at producere på en højere titer end andre (f.eks. AAV2)41. Udfældning af vektoren, under trinnet udvanding kan være en mulig årsag til en lavere titer og forhindres nemt ved at undgå overkoncentration33. Derudover er det også muligt, at effektiviteten af iodixanol gradient-baserede rensning lidt varierer mellem serotyper, og derfor, forskelle i titer fås med forskellige serotyper kan observeres41.
Endelig skal det påpeges, at selv om qPCR er en meget præcis metode til DNA kvantificering nogle iboende variabilitet i teknikken kan observeres. Nøjagtighed i titreringen afhænger primært præcis pipettering og korrekt vortexing af alle løsninger. For at garantere den mest nøjagtige titer læsning, qPCR uafhængigt kan gentages, og de opnåede værdier i gennemsnit. Valget af primere præsenteret i denne protokol er baseret på rækkefølgen af CBA initiativtageren beliggende i pTransgene plasmid brugt i vores laboratorium. CBA promotor er en stærk syntetiske promotor, som er meget udbredt i feltet vektor at drive udtryk på tværs af flere celletyper. Det indeholder flere elementer, herunder cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; initiativtageren, første exon og den første intron af CBA gen; og splejsning acceptoren af kanin β-globin genet. Men primere kan være konstrueret til stort set ethvert element, som ligger i udtrykket kassette (herunder promotor, transgene og regulerende elementer). Sammenligning af titer på tværs af partier er også muligt, at yde primere bruges mod regioner fælles for de pågældende vektorer.
Til sidst, kan denne protokol bruges til at producere AAV vektorer med en række capsids, genom konfigurationer, promoter typer og transgen laster. Dette vil tillade brugere at nemt tilpasse de endelige egenskaber ved deres vektorer der passer bedst til eksperimentelle behov. I eksemplet præsenteres i de repræsentative resultater, brugen af PHP. B kapsid, som effektivt krydser BBB, gav højeffektive genekspression i CNS, følgende hale vene injektion32. Systemisk administration af CNS penetrant vektorer har betydelige fordele i form af mulige bivirkninger2,17,32. Et muligt alternativ til perifere injektion, samtidig undgå forbehold af invasive teknikker, er Intratekal levering, som består af levering af AAV vektor i cerebrospinalvæsken. Denne leveringsbetingelser rute er vist sig for at være effektiv, viser udbredt udtryk af transgenet i hele CNS, mindre off target effekter i perifere organer, og lave niveauer af immunrespons42. Intratekal injektioner er dog meget mere udfordrende, da de kræver højere tekniske færdigheder end halen vene injektion.
Kapsid videreudvikling at forfine denne teknologi vil blive drevet af mulighederne for AAV vektor brug i gen terapi programmer. Sådanne tilgange tilbyde attraktive muligheder for at behandle i øjeblikket uhelbredelig CNS lidelser, såsom Amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom, Parkinsons og Alzheimers sygdom18.
The authors have nothing to disclose.
M.R. understøttes af en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoc stipendium (133722/1204517N) og for kontinuerlig støtte af Fundación hjerte-kar-de Colombia og den Administrative afdeling for videnskab, Teknologi og Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkode 656671250485). M.M. er understøttet af et CVE ph.d.-stipendium (1S48018N). M.G.H. blev støttet af en VIB institutionelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), The Foundation for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det Europæiske Forskningsråd (ERC) (starter Grant 281961 – AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 – annonce-VIP). Forfatterne anerkender Jeason Haughton for hans hjælp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hendes hjælp udfører hale vene injektioner og Caroline Eykens for at levere billeder af transfekteret HEK293T celler. M.G.H. erkender Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |