यहां, हम एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन करने के लिए उत्पादन, titer, और adeno के गुणवत्ता नियंत्रण बैचों-जुड़े वायरस वैक्टर । यह उपयोगकर्ता उच्च-titer (≥ 1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल) और एक उच्च शुद्धता के साथ एक वेक्टर तैयारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, इन विट्रो में या vivo उपयोग में के लिए तैयार है ।
adeno-जुड़े विषाणुओं पर आधारित जीन वितरण उपकरण (AAVs) जीन थेरेपी अनुप्रयोगों सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को transgenes के वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प हैं । AAV वैक्टर गैर नकल कर रहे हैं, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम है और दीर्घकालिक transgene अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण बात, कुछ serotypes, जैसे कि नव वर्णित PHP । बी, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) पशु मॉडलों में पार कर सकते हैं, प्रणालीगत प्रसव के बाद । AAV वैक्टर कुशलता से प्रयोगशाला में उत्पादन किया जा सकता है । हालांकि, मजबूत और reproducible प्रोटोकॉल पर्याप्त शुद्धता के स्तर के साथ AAV वैक्टर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और vivo अनुप्रयोगों में पर्याप्त उच्च titer मान । इस प्रोटोकॉल एक iodixanol ढाल शोधन रणनीति के आधार पर, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन । iodixanol शुद्धिकरण विधि उच्च शुद्धता के उच्च titer AAV वैक्टर के बैचों प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है, जब अन्य शोधन विधियों की तुलना में. इसके अलावा, प्रोटोकॉल आम तौर पर तेजी से अंय तरीकों से वर्तमान में वर्णित है । इसके अलावा, एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) आधारित रणनीति वेक्टर titer का एक तेजी से और सही निर्धारण के लिए, साथ ही एक चांदी धुंधला विधि वेक्टर बैच की पवित्रता का निर्धारण करने के लिए वर्णित है । अंत में, सीएनएस को जीन वितरण के प्रतिनिधि परिणाम, AAV-PHP के प्रणालीगत प्रशासन के बाद । बी, प्रस्तुत कर रहे हैं । इस तरह के परिणाम सभी प्रयोगशालाओं में इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संभव होना चाहिए ।
पिछले 30 वर्षों में, वंय प्रकार AAVs को रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर, जो1,2,3,4सीएनएस में जीन हस्तांतरण के लिए असाधारण उपयोगी उपकरण साबित हो गया है बनाने के लिए इंजीनियर किया गया है, 5,6 और जीन थेरेपी रोग के लिए दृष्टिकोण (एफडीए सहित-और EMA-अनुमोदित चिकित्सा)4,7। सीएनएस में उपयोग के लिए उनकी उपयुक्तता काफी हद तक संक्रमित गैर-विभाजित, पोस्ट-mitotic कोशिकाओं, आम तौर पर8सीएनएस में पाया करने की क्षमता से निकला है । हालांकि, AAV आधारित वैक्टर भी किसी भी चिकित्सीय transgene4,9 की एक लंबी अवधि के अभिव्यक्ति की अनुमति का लाभ है, जबकि अंय वायरल वैक्टर7की तुलना में एक मामूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना, 8,10,11,12.
किसी भी AAV वेक्टर के मुख्य तत्व जीनोम और कैप्सिड हैं । वाइल्ड-टाइप AAVs लगभग 5 kilobases (केबी)13के जीनोम के साथ सिंगल-कतरा (ss) डीएनए वायरस है । रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर के उत्पादन के लिए, प्रतिनिधि और टोपी जीन (जीनोम प्रतिकृति और वायरल कैप्सिड के विधानसभा के लिए आवश्यक) जंगली प्रकार AAV के जीनोम से हटा दिया और ट्रांस मेंप्रदान की जाती हैं, एक के लिए कमरे में जा अभिव्यक्ति कैसेट युक्त transgene14,15. उल्टे टर्मिनल दोहराने अनुक्रम मूल वायरल जीनोम के (ITRs) एक AAV वेक्टर में ही बने तत्वों रहे हैं, के रूप में इन प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए आवश्यक है3,10,14। AAV वैक्टर transgene अभिव्यक्ति बढ़ाने के लिए इंजीनियर जा सकता है; ITRs में से एक में उत्परिवर्तन एक hairpin पाश के गठन की ओर जाता है जो प्रभावी ढंग से एक पूरक डीएनए किनारा3,7,15की पीढ़ी की अनुमति देता है । इस विंयास का मुख्य लाभ, एक आत्म पूरक (अनुसूचित जाति) जीनोम, कि यह AAVs के पारंपरिक जीवन चक्र में ठेठ दूसरा किनारा संश्लेषण की आवश्यकता नजरअंदाज, काफी गति और transgene अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि 1. फिर भी, एक scAAV जीनोम का उपयोग कर लगभग २.४ kb के लिए वेक्टर के कार्गो क्षमता कम कर देता है । यह transgene अनुक्रम, साथ ही किसी भी नियामक अनुक्रम जैसे प्रवर्तकों या microRNA-बाइंडिंग साइट्स, विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए16शामिल हैं ।
AAV कैप्सिड वेक्टर-होस्ट सेल इंटरैक्शन निर्धारित करता है और किसी AAV सीरोटाइप के लिए सेल प्रकार या टिशू tropism की डिग्री प्रदान करती है, जिसे विशिष्ट स्थानों पर transgene अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है । कई AAV serotypes प्रकृति में पाए जाते हैं, जबकि अंय प्रयोगशालाओं में रिकॉमबिनेंट दृष्टिकोण के माध्यम से उत्पादन किया गया है (यानी, PHP । ख). इसके अलावा, कुछ capsids भी अंय उपयोगी विशेषताओं, इस तरह के BBB पार करने की क्षमता के रूप में, प्रणालीगत प्रशासन के बाद सीएनएस भर transgenes के वितरण में जिसके परिणामस्वरूप । यह AAV9 के लिए दिखाया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में हाल ही में PHP वर्णित है । B कैप्सिड17. एक परिणाम के रूप में, इन serotypes neurodegenerative विकारों1,17,18के लिए नए जीन थेरेपी के दृष्टिकोण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक साबित हो रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य उच्च titer और शुद्धता के साथ AAV वैक्टर के छोटे पैमाने पर उत्पादन के लिए एक लागत प्रभावी विधि का वर्णन है । हालांकि परिणाम यहां प्रस्तुत PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड और एक scAAV अभिव्यक्ति कैसेट, प्रोटोकॉल कई AAV वेक्टर serotypes और जीनोम विंयास के उत्पादन के लिए उपयुक्त है, अधिकतम प्रयोगात्मक लचीलापन की अनुमति । हालांकि, वेक्टर उपज और अंतिम पवित्रता चुना सीरोटाइप के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
प्रोटोकॉल ही वायरल वेक्टर उत्पादन के लिए शास्त्रीय त्रिकोणीय अभिकर्मक विधि का एक संस्करण है और वेक्टर साफ अप के लिए एक iodixanol ढाल के उपयोग को शामिल किया गया है, जो, सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) ढाल के शास्त्रीय उपयोग की तुलना में, गया है अधिक समय में उच्च शुद्धता के AAV वैक्टर उत्पादन करने के लिए रिपोर्ट कुशल तरीके से19,20,21।
अभिकर्मक, शुद्धि और एकाग्रता कदम एक ऊतक संस्कृति वायरल वेक्टर काम के लिए रेटेड प्रयोगशाला में अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) के अनुसार किया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं । प्रत्येक कार्य के लिए प्रासंगिक स्थानीय और राष्ट्रीय वायरल वेक्टर उत्पादन और उपयोग के विषय में कानून के अनुपालन में किया जाना चाहिए । काम एक लामिना प्रवाह हुड के नीचे और बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए । वेक्टर सुविधा के अंदर, यह नियमित रूप से ऊतक संस्कृति लैब कोट के अलावा एक प्रयोगशाला एप्रन पहनने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, दस्ताने की एक डबल जोड़ी, साथ ही प्लास्टिक के जूते, हर समय पर पहना जाना चाहिए ।
वेक्टर उत्पादन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक उपकरण और plasmids उपलब्ध हैं । 1) pCapsid प्लाज्मिड प्रतिनिधि जीन है कि चार गैर संरचनात्मक प्रतिकृति, अर्थात् Rep78, Rep68, Rep52, और Rep40, और टोपी जीन है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना तीन संरचनात्मक कैप्सिड प्रोटीन, अर्थात् VP1, VP2, और VP3 के लिए आवश्यक encodings शामिल हैं । 2) pHelper प्लाज्मिड एडीनोवायरस, जो AAV कोशिकाओं में HEK293T उत्पादन की सुविधा से जीन E4, E2A, और VA शामिल हैं । 3) pTransgene प्लाज्मिड transgene अभिव्यक्ति कैसेट, दो ITRs द्वारा पार्श्व शामिल हैं । इन plasmids को प्रयोगशाला में डी नोवो को संश्लेषित किया जा सकता है जो ऑनलाइनउपलब्ध अनुक्रम का उपयोग कर रहा है । plasmids के लिए डी नोवोबनाया, विशेष रूप से उन उपंयास transgenes युक्त, अनुक्रमण, सुनिश्चित करें कि transgene और ITRs सही है बनाने के लिए आवश्यक है । वैकल्पिक रूप से, निर्मित plasmids सीधे ऑनलाइन प्लाज्मिड खजाने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । जब आवश्यक हो, plasmids प्रवर्धित और मानक किट का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है, निर्माता के निर्देश के अनुसार23.
वेक्टर titer और पवित्रता सदिश की transduction क्षमता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है । अतिरिक्त प्रोटोकॉल उत्पादित वेक्टर की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए आपूर्ति की जाती है । अंतिम वैक्टर दोनों विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में सीएनएस सेल समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर का उत्पादन यहां वर्णित सामग्री और सबसे आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं और सेल संस्कृति सुविधाओं के लिए आम उपकरण का उपयोग करता है । यह उपयोगकर्ता शुद्ध प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, नैदानिक ग्रेड AAV वैक्टर कि इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में की एक श्रृंखला में एकाधिक सेल और ऊतक प्रकार के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का सबसे बड़ा लाभ में से एक, दूसरों की तुलना में (यानी, CsCl आधारित शुद्धि), कम काम समय की जरूरत है । तैयार करने के लिए उपयोग AAV वैक्टर HEK293T कोशिकाओं के प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद 6 कार्य दिवसों की एक अधिकतम में प्राप्य हैं ।
कई कारकों नकारात्मक अंतिम उपज या AAV वेक्टर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । गरीब अभिकर्मक दक्षता एक कम वायरल उपज३३के लिए मुख्य कारणों में से एक है । एक प्रमुख सिफारिश HEK293T कोशिकाओं है कि 20 से अधिक बार नहीं किया गया है और एक सेल संगम अभिकर्मक21के समय ९०% से अधिक नहीं है का उपयोग है । इसके अलावा, अभिकर्मक विधि चयनित परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है । यह प्रोटोकॉल बेई के उपयोग पर आधारित है । पी बेई और न्यूक्लिक एसिड के परिसरों की पीढ़ी के माध्यम से सेल नाभिक को exogenous डीएनए देने की क्षमता के साथ एक cationic बहुलक है, polyplexes, जो सेल द्वारा उठाए गए है और endosomes३४के माध्यम से अवैध रूप से जाना जाता है के रूप में जाना जाता है । पी-आधारित अभिकर्मक आसान और तेजी से प्रदर्शन करने के लिए है, इसके विपरीत में अन्य व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों, जैसे कैल्शियम फॉस्फेट३५के साथ सह डीएनए की वर्षा के रूप में. इसके अलावा, पी आधारित अभिकर्मक बहुत सस्ता है जब अंय नए शुरू तरीकों की तुलना में ऐसे cationic लिपिड और चुंबक के उपयोग के रूप में, अभिकर्मक३६मध्यस्थता ।
शुद्धिकरण रणनीति प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । अंय तरीकों की तुलना में, iodixanol आधारित शुद्धि के लिए खाली वायरल कणों का एक उच्च प्रतिशत शामिल करते है (20%)20। यह ऑफसेट है, एक हद तक, तथ्य यह है कि iodixanol आधारित शुद्धि नियमित रूप से एक कण के साथ AAV सदिश की तैयारी में परिणाम-से कम १०० के अनुपात infectivity । यह पारंपरिक CsCl-आधारित प्रक्रियाओं की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके लिए कण infectivity की पर्याप्त हानि३७की सूचना दी है । एक अंय आम वैकल्पिक विधि AAV वैक्टर शुद्ध करने के लिए क्रोमैटोग्राफी आधारित शुद्धि है । हालांकि, इस विधि प्रमुख दोष है कि एक विशिष्ट कॉलम प्रत्येक वेक्टर कैप्सिड इस्तेमाल के लिए आवश्यक है: उदाहरण के लिए, जबकि AAV2 प्रतिष्ठित हेपरिन कॉलम का उपयोग कर अलग है, इस पद्धति AAV4 और AAV5, जो हेपरिन-बाध्यकारी अधिकारी के साथ काम नहीं करता है उनके capsids३८पर साइटें । यह देखते हुए कि क्रोमैटोग्राफी शुद्धि भी महंगा है, iodixanol आधारित शुद्धि आम तौर पर एक छोटे पैमाने३३,३९पर AAV वैक्टर के उच्च गुणवत्ता बैचों का उत्पादन करने के लिए इच्छा है कि प्रयोगशालाओं के लिए अधिक उपयुक्त है, ४०. हालांकि, अंतिम उपज और सदिश की शुद्धता को अधिकतम करने के लिए, चरम देखभाल की जरूरत है जब iodixanol ढाल बनाते हैं । विभिंन iodixanol भिन्न ultracentrifugation ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट जिसका टिप ट्यूब की दीवार को छू रहा है का उपयोग कर: iodixanol धीरे और लगातार पिपेट से निष्कासित कर दिया जाना चाहिए. के रूप में वेक्टर कणों ४०% iodixanol परत में जमा, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि ढाल इंटरफेस20मिश्रण नहीं है लिया जाना चाहिए । अंत में, सदिश युक्त अंश 20 ग्राम से अधिक नहीं गेज के साथ एक स्टेनलेस स्टील कुंद सुई के सम्मिलन से पुनर्प्राप्त किया जाना चाहिए वेक्टर वसूली को अधिकतम करने के लिए, स्पष्ट अंश अपनी संपूर्णता में प्राप्त किया जाना चाहिए । इस चरण के दौरान, समय महत्वपूर्ण है । तैयारी की पवित्रता समझौता से बचने के लिए, यह आवश्यक है कि संकलन को रोकने के लिए अंय (दूषित) ढाल के चरणों से पहले एकत्र कर रहे हैं ।
प्राप्त वेक्टर titer में अंतर भी वेक्टर के डिब्बाबंद कणों का उत्पादन करने के लिए आंतरिक क्षमता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । विभिंन AAV serotypes के बीच एक तुलना पता चला है कि कुछ AAV वैक्टर अधिक दूसरों की तुलना में एक उच्च titer में उत्पादन मुश्किल है (जैसे, AAV2)४१। वेक्टर की वर्षण के दौरान, एक कम titer के लिए एक संभावित कारण हो सकता है और आसानी से३३एकाग्रता से परहेज द्वारा रोका । इसके अलावा, यह भी संभव है कि iodixanol ढाल आधारित शुद्धि की दक्षता थोड़ा serotypes के बीच अलग है और इसलिए, अलग serotypes के साथ प्राप्त titer में विसंगतियों४१मनाया जा सकता है ।
अंत में, यह कहा जा करने की जरूरत है कि भले ही qPCR डीएनए के लिए एक बहुत ही सटीक तरीका है ठहराव तकनीक में कुछ निहित परिवर्तनशीलता मनाया जा सकता है । अनुमापन में सटीकता मुख्य रूप से सटीक pipetting और सभी समाधानों के उचित भंवर पर निर्भर करता है । सबसे सटीक titer पढ़ने की गारंटी के लिए, qPCR स्वतंत्र रूप से दोहराया जा सकता है, और प्राप्त मूल्यों औसत । इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्राइमरों का चुनाव हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त pTransgene प्लाज्मिड में स्थित CBA प्रवर्तक के अनुक्रम पर आधारित है. CBA प्रमोटर एक मजबूत सिंथेटिक प्रमोटर है कि व्यापक रूप से वेक्टर क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है एकाधिक सेल प्रकार के पार अभिव्यक्ति ड्राइव है । यह cytomegalovirus (सीएमवी) जल्दी बढ़ाने तत्व सहित कई तत्वों, शामिल हैं; प्रवर्तक, प्रथम एक्सॉन, और CBA जीन के प्रथम intron; और खरगोश β-ग्लोबिन जीन का ब्याह स्वीकार । हालांकि, प्राइमर वस्तुतः किसी भी अभिव्यक्ति कैसेट (प्रमोटर, transgene, और विनियामक तत्वों सहित) के भीतर स्थित तत्व के लिए डिजाइन किया जा सकता है । बैचों भर में titer की तुलना भी संभव है, प्राइमरों के लिए आम क्षेत्रों के खिलाफ इस्तेमाल किया जाता है सवाल में वैक्टर ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल के लिए capsids, जीनोम विंयास, प्रमोटर प्रकार और transgene कार्गो की एक किस्म के साथ AAV वैक्टर उत्पादन किया जा सकता है । यह उपयोगकर्ताओं को आसानी से अपने वैक्टर के अंतिम विशेषताओं के अनुकूलन के लिए सबसे अच्छा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप करने की अनुमति देगा । प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत उदाहरण में, PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड, जो कुशलतापूर्वक BBB पार, सीएनएस में अत्यधिक कुशल जीन अभिव्यक्ति दी, निंनलिखित पूंछ नस इंजेक्शन३२। सीएनएस व्याप्ति वैक्टर के प्रणालीगत प्रशासन संभव पक्ष प्रभाव2,17,३२के मामले में काफी लाभ है । परिधीय इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प है, जबकि आक्रामक तकनीक की निरंतर परहेज, intrathecal वितरण है, जो मस्तिष्कमेरु द्रव में AAV वेक्टर के वितरण के होते हैं । इस वितरण मार्ग को प्रभावी, सीएनएस भर में transgene की व्यापक अभिव्यक्ति दिखा साबित हो रहा है, कम से परिधीय अंगों में लक्ष्य प्रभाव, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया४२के निंन स्तर । वे पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में उच्च तकनीकी कौशल की आवश्यकता के रूप में हालांकि, intrathecal इंजेक्शन, बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण हैं ।
इसके अलावा कैप्सिड विकास इस प्रौद्योगिकी को परिष्कृत करने के लिए जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में AAV वेक्टर उपयोग के लिए अवसरों के द्वारा संचालित किया जाएगा । इस तरह के दृष्टिकोण पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग18के रूप में वर्तमान में लाइलाज सीएनएस विकारों के इलाज के लिए आकर्षक संभावनाएं प्रदान करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
यूननट एक शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) postdoctoral फैलोशिप (133722/1204517N) द्वारा समर्थित है और Fundación हृदय डे कोलंबिया और विज्ञान के प्रशासनिक विभाग के सतत समर्थन स्वीकार करता है, प्रौद्योगिकी और नवाचार (अनुदान सीटी-FP44842-307-2016, परियोजना कोड ६५६६७१२५०४८५). M.M. an FWO डॉक्टरेट फैलोशिप (1S48018N) द्वारा समर्थित है । M.G.H. एक VIB संस्थागत अनुदान और थियरी Latran फाउंडेशन (वतन वीआईपी), अल्जाइमर अनुसंधान (साओ-एफआरए) (पी # 14006), FWO (अनुदान 1513616N), और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) के लिए फाउंडेशन से बाहरी समर्थन द्वारा समर्थित था (शुरू अनुदान २८१९६१-AstroFunc; अवधारणा अनुदान ७१३७५५-विज्ञापन-वीआईपी) का सबूत । लेखक माउस पशुपालन के साथ उनकी मदद के लिए Jeason Haughton स्वीकार करते हैं, उसे पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने में मदद के लिए स्टेफ़नी Castaldo, और Eykens transfected कोशिकाओं की छवियों को प्रदान करने के लिए कैरोलीन HEK293T । M.G.H. माइकल डनलप, पीटर Hickman, और डीन हैरिसन स्वीकार करता है ।
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |