Her beskriver vi en effektiv og reproduserbar strategi å produsere titer og kvalitetskontroll grupper av adeno-assosiert virus vektorer. Det lar brukeren få en vektor forberedelse med høy-titer (≥1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høy renhet, klar til bruk i vitro eller vivo .
Gen levering verktøy basert på adeno-assosiert virus (AAVs) er et populært valg for levering av effekter av transgener til sentralnervesystemet (CNS), inkludert gene terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan infisere både dele og ikke dele celler og gi langsiktig transgene uttrykk. Viktigere, noen serotyper, som nylig beskrevet PHP. B, kan krysse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, etter systemisk levering. AAV vektorer kan være effektivt produsert i laboratoriet. Robust og reproduserbar protokoller er imidlertid nødvendig for å hente AAV vektorer med tilstrekkelig renhet nivåer og titer verdiene høy nok for i vivo programmer. Denne protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar strategi for AAV vektor produksjon basert på en iodixanol gradient rensing strategi. Iodixanol rensing metoden er egnet for å få grupper av høy-titer AAV vektorer av høy renhet, sammenlignet med andre metoder for rensing. Videre er protokollen raskere enn andre metoder for øyeblikket beskrevet. I tillegg en kvantitativ polymerase kjede reaksjon (qPCR)-basert strategi er beskrevet for en rask og nøyaktig bestemmelse av vektor titer, samt en silver flekker metode å avgjøre renheten av vektor bunken. Til slutt, representant resultatene av genet levering til CNS etter systemisk administrasjon av AAV-PHP. B, presenteres. Slike resultater bør være mulig i alle labs ved hjelp av protokoller som er beskrevet i denne artikkelen.
De siste 30 årene, har vill-type AAVs blitt utviklet for å opprette rekombinant AAV vektorer, som har vist seg for å være svært nyttig verktøy for genoverføring til CNS1,2,3,4, 5,6 og gene terapi tilnærminger til sykdom (inkludert FDA – og EMA-godkjent terapi)4,7. Deres egnethet for bruk i CNS stammer hovedsakelig fra deres evne til å infisere ikke dele, etter mitotisk celler, vanligvis finnes i CNS8. Men har AAV-baserte vektorer også fordelen at en langsiktig uttrykk for enhver gitt terapeutiske transgene4,9 mens fremlokkende en mildere immunrespons sammenlignet med andre viral vektorer7, 8,10,11,12.
Hovedelementene i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Vill-type AAVs er enkelt-strandet (ss) DNA virus med et genom omtrent 5 kilobases (kb)13. For produksjon av rekombinant AAV vektorer, rep og cap genene (nødvendig for genomet replikering og montering av viral kapsid) slettes fra genomet av vill-type AAV og gitt i trans, forlater rommet for en uttrykket kassett som inneholder transgene14,15. Invertert terminal gjenta sekvenser (ITRs) av det opprinnelige viral genomet er bare beholdt elementene i en AAV vektor, ettersom disse er avgjørende for replikering og emballasje3,10,14. AAV vektorer kan være konstruert for å forbedre transgene uttrykk. en mutasjon i en av ITRs fører til dannelsen av en hårnål loop som effektivt tillater generering av en komplementære DNA strand3,7,15. Den største fordelen med denne konfigurasjonen kalles en selv-utfyllende (sc) genom, er at det omgår behovet for andre-strand syntese vanlig i AAVs, betydelig øke hastigheten og nivåer av transgene uttrykket konvensjonelle livssyklus 1. likevel bruke en scAAV genomet reduserer lastekapasitet på vektoren til ca 2.4 kb. Dette inkluderer transgene sekvenser, samt noen regulatoriske sekvenser som arrangører eller microRNA bindende områder, for å begrense uttrykk til bestemte cellen typer16.
AAV kapsid bestemmer vektor-verten celle samspillet og gir en grad av celle type eller vev tropism for en AAV serotype, som kan også utnyttes til å begrense transgene uttrykk til bestemte steder. Flere AAV serotyper finnes i naturen, mens andre er produsert i laboratorier gjennom rekombinant tilnærminger (dvs. PHP. B). dessuten noen capsids også gi andre nyttige egenskaper, for eksempel muligheten til å krysse BBB, resulterer i levering av effekter av transgener i CNS når systemisk administrasjon. Dette har vist for AAV9 og nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som en konsekvens, viser disse serotyper seg for å være spesielt relevant for nye gene terapi tilnærminger nevrodegenerative lidelser1,17,18.
Målet med denne protokollen er å beskrive en kostnadseffektiv metode for småskala produksjon av AAV vektorer med høy titer og renhet. Selv om resultatene presenteres her bruk PHP. B kapsid og en scAAV uttrykk kassett, protokollen er egnet for produksjon av flere AAV vektor serotyper og genom konfigurasjoner, slik at eksperimentelle fleksibilitet. Imidlertid kan vektor avkastning og endelige renhet variere avhengig av den valgte serotype.
Protokollen er en variant av klassisk tri-transfection metoden for viral vektor produksjon og omfatter bruk av en iodixanol gradering for vektor opprydning, som, i forhold til den klassiske bruken av cesium chloride (CsCl) graderinger, er rapportert for å produsere AAV vektorer av høyere renhet i en mindre tidkrevende måte19,20,21.
Hva, rensing og konsentrasjon trinnene skal utføres i henhold til god laboratoriepraksis (GLP) i et vev kultur laboratorium vurdert for viral vektor arbeidet. Hver aktivitet må utføres i henhold til relevante lokale og nasjonale lovgivningen om viral vektor produksjon og bruk. Arbeidet må utføres under laminær strømning hette og sterile forhold. Inne vektor anlegget anbefales det å ha en lab forkle, i tillegg til den vanlige vev kultur lab coat. Videre bør et dobbelt par hansker, samt plast overtrekk på, brukes til alle tider.
Før starter vektor produksjon, sikre alt nødvendig utstyr og plasmider er tilgjengelig. 1) pCapsid plasmider inneholder rep genet som koder fire ikke-strukturelle proteiner nødvendig for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og cap genet som koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmider inneholder genene E4 E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produksjon i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmider inneholder transgene uttrykk kassetten, flankert av to ITRs. Disse plasmider kan være syntetisk de novo i laboratoriet ved hjelp sekvenser tilgjengelig online22. Plasmider laget de novo, er spesielt de som inneholder romanen effekter av transgener, sekvensering nødvendig, sørge for at transgene og ITRs er riktig. Alternativt kan forhåndslagde plasmider være direkte ervervet gjennom online plasmider repositories. Når det er nødvendig, plasmider kan bli forsterket og renset med standard kits, i henhold til produsentens instruksjoner23.
Vector titer og renhet kan påvirke signaltransduksjon evne til vektor. Ytterligere protokoller leveres for å vurdere kvaliteten på produsert vektoren. Siste vektorer vil være nyttig for studier av CNS celle-funksjonen i både i vitro og vivo programmer.
Produksjon av rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruker materialer og utstyr som er felles for de fleste molekylær biologi labs og celle kultur fasiliteter. Det lar brukeren få ren, preklinisk klasse AAV vektorer som kan brukes til å målrette flere celler og vev typer over en rekke i vitro og vivo applikasjoner. En av de største fordelene med denne protokollen, sammenlignet med andre (dvs. CsCl-baserte rensing), er kortere arbeidstid nødvendig. Klar til bruk AAV vektorer er oppnåelig i maksimum 6 virkedager etter den første transfection HEK293T celler.
Flere faktorer kan negativt påvirke den endelige avkastningen eller kvaliteten på AAV vektoren. Dårlig hva effektivitet er en av hovedårsakene til en lav viral yield33. En stor anbefaling er bruken av HEK293T celler som ikke har vært passaged mer enn 20 ganger og ikke har en celle samløpet større enn 90% ved transfection21. Dessuten, har hva metoden valgt stor innvirkning på resultatene. Denne protokollen er basert på bruk av PEI. PEI er en kationisk polymer muligheten til å levere eksogene DNA til cellekjernen gjennom generasjon komplekser av polymer og nucleic acid, kjent som polyplexes, som er tatt opp av celle- og menneskehandel via endosomes34. PEI-baserte hva er enkelt og raskt å utføre, i motsetning til andre brukte metoder, som co nedbør av DNA med kalsium fosfat35. PEI-baserte transfection er også mye billigere sammenlignet med andre nylig introduserte metoder, som bruken av kationisk lipider og magnet-mediert transfection36.
Rensing strategien spiller en nøkkelrolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserte renselser tendens til å inneholde en høyere prosentandel av Tom virus partikler (20%)20. Dette er motvirket, til en grad, for av det faktum at iodixanol-baserte rensing rutinemessig resulterer i AAV vektor preparater med en partikkel-til-infectivity ratio på mindre enn 100. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle CsCl-baserte prosedyrer, som er betydelige tap av partikkel infectivity rapporterte37. En annen vanlig alternativ metode å rense AAV vektorer er Ture-baserte rensing. Denne metoden har imidlertid den store ulempen at det kreves en bestemt kolonne for hver vektor kapsid brukes: for eksempel mens AAV2 er klassisk isolere benytter heparin kolonner, denne metoden fungerer ikke med AAV4 og AAV5, som ikke har heparin-bindende steder på deres capsids38. Tatt i betraktning at kromatografi rensing er også dyr, er iodixanol-baserte rensing generelt mer egnet for laboratorier som ønsker å produsere høykvalitets grupper av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. imidlertid for å maksimere siste avkastning og renhet av vektoren, forsiktig er nødvendig når du gjør den iodixanol forløpninger. Ulike iodixanol fraksjoner skal overføres til ultracentrifugation røret med en bakteriefri Pasteur pipette som har tipset er rørende veggen av røret: iodixanol bør bli utvist fra pipette sakte og kontinuerlig. Som vektor partikler akkumuleres i 40% iodixanol laget, må omsorg tas for å sikre at gradient grensesnittene ikke blander20. Til slutt, brøkdel inneholder vektoren skal hentes ved innsetting av en rustfritt stål sløv nål med en måler ikke større enn 20 G. For å maksimere vektor utvinning, skal klart brøken hentes i sin helhet. I dette trinnet er timingen kritiske. For å unngå forlegenhet renheten av preparatet, er det viktig å stoppe samlingen før andre (forurensende) faser av graderingen er samlet.
Forskjeller i innhentet vektor titer kan også tilskrives iboende evne til vektoren å produsere pakket partikler. En sammenligning mellom ulike AAV serotyper viste at noen AAV vektorer er vanskeligere å produsere på en høyere titer enn andre (f.eks AAV2)41. Nedbør av vektoren, under det avsalting trinnet kan være en mulig årsak til en lavere titer og forhindret lett ved å unngå overconcentration33. Dessuten, det er også mulig at effektiviteten av iodixanol forløpning-baserte rensing litt forskjellig mellom serotyper, og derfor avvik titer med forskjellige serotyper kan observeres41.
Til slutt må påpekes at selv om qPCR er en svært nøyaktig metode for DNA kvantifisering kan noen iboende variasjon i teknikken observeres. Nøyaktighet i Serine avhenger hovedsakelig nøyaktige pipettering og riktig vortexing for alle løsningene. For å garantere den mest nøyaktige titer lesing, qPCR kan være uavhengig gjentas, og fått verdiene i gjennomsnitt. Valg av primere presentert i denne protokollen er basert på rekkefølgen av CBA arrangøren i pTransgene plasmider brukes i vårt laboratorium. CBA er en sterk syntetisk promoter som er mye brukt i feltet vektor stasjonen uttrykk over flere celletyper. Den inneholder flere elementer, inkludert cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; arrangøren, første ekson og den første intron av CBA genet; og skjøte acceptor av kanin β-globin genet. Men kan primere være konstruert for nesten alle elementet ligger uttrykk kassetten (inkludert arrangøren, transgene og regulatoriske elementer). Sammenligning av titer på tvers av grupper er også mulig, gir deg primere brukes mot regioner felles for vektorer i spørsmålet.
Avslutningsvis kan denne protokollen brukes til å produsere AAV vektorer med en rekke capsids, genomet konfigurasjoner, formidler typer og transgene cargos. Dette vil tillate brukere å enkelt tilpasse seg siste kjennetegner deres vektorer som passer eksperimentelle behov. I eksemplet i representant resultatene, bruk av PHP. B kapsid, som effektivt krysser BBB, ga høyeffektive genuttrykk i CNS følgende hale blodåre injeksjon32. Systemisk administrasjonen av CNS penetrant vektorer har betydelige fordeler i form av mulige bivirkninger2,17,32. Et mulig alternativ til eksterne injeksjon, og unngå begrensningene av invasiv teknikker, er intratekal levering, som består av levering av AAV vektoren i spinalvæske. Denne levering ruten er bevist for å være effektive, viser utbredt uttrykket av transgene over CNS mindre off-målet effekter i eksterne organer og lave nivåer av immunrespons42. Imidlertid er intratekal injeksjoner mye mer utfordrende, siden de krever høyere tekniske ferdigheter enn hale blodåre injeksjon.
Kapsid videreutvikling å avgrense denne teknologien vil bli drevet av muligheter for AAV vektor bruk gene terapi. Disse tilbyr attraktive muligheter til å behandle er uhelbredelig CNS lidelser, som amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Parkinsons og Alzheimers18.
The authors have nothing to disclose.
Mr støttes av en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorstipend (133722/1204517N) og anerkjenner kontinuerlig Fundación hjerte de Colombia og Administrative Department of Science, Teknologi og innovasjon (gi CT-FP44842-307-2016, prosjektkode 656671250485). Mm støttes av en CVE doktorgrad fellesskap (1S48018N). M.G.H. ble støttet av en VIB institusjonelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (TORV-VIP), stiftelsen for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det europeiske Research Council (ERC) (starter Grant 281961 – AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 – AD-VIP). Forfatterne bekrefter Jeason Haughton for hans hjelp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hennes hjelp med å hale blodåre injeksjoner og Caroline Eykens for å gi bilder av transfekterte HEK293T celler. M.G.H. erkjenner Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |