Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

Summary

Wir beschreiben ein chirurgisches Verfahren, das zur indufären Ischämie bei Kaninchen mit Hyperlipidämie und Diabetes eingesetzt wird. Diese Operation dient als präklinisches Modell für Erkrankungen der peripheren Arterienerkrankung bei Patienten. Die Angiographie wird auch als Mittel zur Messung des Ausmaßes der eingeführten Ischämie und der Wiederherstellung der Perfusion beschrieben.

Abstract

Periphere Gefäßerkrankungen sind ein weit verbreitetes klinisches Problem, das Millionen von Patienten weltweit betrifft. Eine wesentliche Folge der peripheren Gefäßerkrankungen ist die Entwicklung von Ischämie. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen entwickeln, bei der sie ständige Schmerzen und ein erhöhtes Risiko für eine Amputation der Gliedmaßen erfahren. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören die Bypass-Chirurgie oder perkutane Eingriffe wie Angioplastik mit Stelzierung oder Atherektomie, um den Blutfluss wiederherzustellen. Diese Behandlungen scheitern jedoch oft an der fortgesetzten Progression von Gefäßerkrankungen oder Restenosen oder sind aufgrund der insgesamt schlechten Gesundheit des Patienten kontraindiziert. Ein vielversprechender möglicher Ansatz zur Behandlung von peripheren Ischämie ist die Induktion der therapeutischen Neovaskularisierung, um dem Patienten die Möglichkeit zu geben, eine Kollateralvaskulatur zu entwickeln. Dieses neu gebildete Netzwerk lindert die periphere Ischämie, indem es die Durchblutung des betroffenen Gebietes wiederherstellt. Das am häufigsten angewandte präklinische Modell für periphere Ischämie nutzt die Entstehung von Hinterbein Ischämie bei gesunden Kaninchen durch Oberschenkelardenliga. In der Vergangenheit gab es jedoch eine starke Trennung zwischen dem Erfolg präklinischer Studien und dem Scheitern klinischer Studien über die Behandlung von peripheren Ischämie. Gesunde Tiere haben in der Regel eine robuste Gefäßregeneration als Reaktion auf chirurgisch induzierte Ischämie, im Gegensatz zu der verminderten Vaskularität und Regeneration bei Patienten mit chronischer peripheren Ischämie. Hier beschreiben wir ein optimiertes Tiermodell für periphere Ischämie bei Kaninchen, das Hyperlipidämie und Diabetes umfasst. Dieses Modell hat die Kollateralbildung und die Blutdruck-Soche im Vergleich zu einem Modell mit einer höheren Cholesterindiät reduziert. So kann das Modell eine bessere Korrelation mit menschlichen Patienten mit kompromittierten Angiogenese aus den gemeinsamen Ko-Morbiditäten, die periphere Gefäßerkrankungen begleiten, bieten.

Introduction

Die periphere arterielle Erkrankung (PAD) ist eine häufige Durchblutungsstörung, bei der das Fortschreiten der atherosklerotischen Plaque-Bildung zu einer Verengung der Blutgefäße in den Gliedmaßen des Körpers führt. Der jüngste Anstieg der Risikofaktoren für Atherosklerose, darunter Diabetes, Fettleibigkeit und Inaktivität, hat zu einer zunehmenden Prävalenz von Gefäßerkrankungen 1 geführt. Derzeit wird geschätzt, dass 12% – 20% der Gesamtbevölkerung über 60 Jahre alt sind, eine arterielle Erkrankung an derPeripherie haben. Eine wichtige Folge der peripheren arteriellen Erkrankung ist die Entwicklung von peripheren Ischämie, die am häufigsten in den unteren Gliedmaßen zu finden ist. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen Ischämie entwickeln, ein Zustand, in dem es aufgrund fehlender Durchblutung ständige Schmerzen gibt. Patienten mit kritischer Gliedmaßen haben eine 50-prozentige Wahrscheinlichkeit, dass ein Gliedmaßen innerhalb eines Jahres nach der Diagnose amputiert wird. Darüber hinaus haben Patienten mit Diabetes eine höhere Inzidenz von peripheren arteriellen Erkrankungen und schlechteren^Ergebnissennach Eingriffen zur Revaskularisierung 3,4^. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören perkutane Eingriffe wie Atherektomie und Stachel-oder chirurgische Umgehung. Für viele Patienten bieten diese Behandlungen jedoch nur kurzfristige Vorteile und viele sind nicht gesund genug für größere chirurgische Eingriffe. In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches Tiermodell zur Erprobung neuer Behandlungen, die auf periphere Gefäßerkrankungen abzielen und die die Entstehung von peripheren Ischämie bei Kaninchen durch chirurgische Ligation im Kontext des diabetischen Krankheitszustandes einbezieht.

Das Modell der Hinterbein bei Kaninchen wird seit über einem halben Jahrhundert mit 5,6^alsphysiologisches Modell für obstruktive Gefäßerkrankungen und präklinische Vorläufer menschlicher Studien eingesetzt. Kaninchen sind aufgrund der entwickelten Muskulatur des Knöchel-und Wadenmuskels oft eine bevorzugte Spezies für Studien an peripheren Ischämie, im Gegensatz zu herkömmlichen großen Tiermodellen, die ungulat sind (Tiere mit Hufen). Mehrere aktuelle Rezensionen haben sich mit der Verwendung dieses Modells und anderer bei der Modellierung von peripheren Gefäßerkrankungen bei Menschen^7,8befasst. Ähnliche Modelle mit Hinterbein Ischämie bei Kaninchen wurden in präklinischen Studien zu Wachstumsfaktoren^{9,10, 11,12, 13,14}, ^{15,16,17,18, 19,20,}Gentherapie²¹,^22,23, ^{24,25, 26, 27,28,29,30}, 31^{,32, 33,34, 35,36,37, 38,39, 40,41, 42,43,44, und}Stammzellen^45,46, 47^,48^{, 49, 50 ,51}für therapeutische Neovaskularisierung in den Gliedmaßen. Leider zeigten die klinischen Studien, die auf diese erfolgreichen Tierstudien folgten, keine signifikanten Vorteile für die Patienten⁵².

Eine vorgeschlagene Erklärung für den Grund für dieses translationale Versagen ist, dass der Zustand der peripheren Ischämie bei menschlichen Patienten eine ist, die Resistenz gegen angiogene Signale^53,54,55 , ^{56 , 57 , 58 , 59}. Mehrere Studien haben Mängel an angiogenen Signalwegen bei Diabetes und Hyperglykämie nachgewiesen. Diabetes und Hyperlipidämie führen zu einem Verlust von Heparansulfat-Proteoglykanen und einer Zunahme von Enzymen, die Heparansulfat schneiden, was einen potenziellen Mechanismus zur Resistenz gegen therapeutische Angiogenesis/Arteriogenese mit Wachstumsfaktoren darstellt. ^{, 61}. Ein wesentliches Merkmal eines Modells für periphere Ischämie sollte daher ein Aspekt der therapeutischen Resistenz sein, damit Therapien im Zusammenhang mit dem Krankheitszustand von menschlichen Patienten bewertet werden können.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Kaninchenmodell der peripheren Ischämie durch chirurgische Ligation der Oberschenkelarterien. In das Modell wird eine Lead-In-Phase mit der Induktion von Diabetes und Hyperlipidämie eingearbeitet. Wir verglich dieses Modell mit einem anderen Modell, das eine höhere Fettdiät ohne Diabetes beinhaltet, und stellten fest, dass das Modell mit Diabetes und niedrigerem Niveau an Hyperlipidämie effektiver bei der Verringerung des Blutgefäßwachstums war. Unser Modell kombiniert Fortschritte, die von verschiedenen Gruppen genutzt wurden, mit dem Ziel, eine praktische und standardisierte Methode zu bieten, um konsistente Ergebnisse in der Forschung an peripheren Gefäßerkrankungen zu erzielen.

Protocol

Studien mit Tieren wurden mit Genehmigung der University of Texas in Austin und des UTHealth Science Center in Houston Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US-Armee durchgeführt. Medizinische Forschung und Materialkommandariat für Forschungsschutz, und in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien für die Tierpflege. 1. Einführung von Diabetes und Hyperlipidämie Übergang der neuseeländischen Kaninchen (4 – 6 Monate …

Representative Results

Nach der Induktion von Diabetes und der Einleitung der Cholesterindiät von 0,1% betrug das Gesamtcholesterin für die Kaninchen mit Diabetes und Cholesterindiät 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen), die im Durchschnitt die Zeitpunkte und Kaninchen hatten. Der BGL-Wert für diese Kaninchen betrug 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen). Ein Zeitverlauf für Blutchemikalien und Beinblutdruckverhältnisse in einem typischen Kaninchen wird in Abbildung …

Discussion

Wir haben ein präklinisches Modell zur induzierten Hinterbeine bei Kaninchen mit Diabetes und Hyperlipidämie vorgestellt. In vielen Studien gibt es Unklarheiten zu der Technik, mit der bei Kaninchen eine Hinterbundsteinischämie hergestellt wird. Bei Mäusen ist die Schwere und Genesung von Hinterbein Ischämie stark abhängig von der Lage, an der die Ligation und die Technik zur Ischiere eingesetzt werden. Die Bedeutung der Technik, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, ist, dass sie die konsequente Induktion von Isc…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Henry Schein Medical	1537468 / 1531434	250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe	VWR	BD309628
10 mL Syringe	VWR	BD309695
10% Formalin	Fisher-Scientific	23-245684
18G Needle	VWR	89219-294
20G Needle	VWR	89219-340
25G Needle	VWR	89219-290
27G Needle	VWR	89219-288
5 mL Syringe	VWR	BD309646
5% Dextrose	Patterson Veterinary	07-800-9689
Acepromazine	Patterson Veterinary	VEDC207
Alfaxalone	Patterson Veterinary	07-891-6051
Alginate	Sigma-Aldrich	PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate	Sigma-Aldrich	A7413
Angiography Equipment	Toshiba	Infinix-i
Angiography Injector	Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008	Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody	Abcam	ab5694	Primary Antibody for IHC
Baytril	Bayer Animal Health	724089904201	Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel	IDEXX	2616	Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff	WelchAllyn		Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor	Vmed Technology		Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine	Henry Schein Medical	6023287
Buprenorphine	Patterson Veterinary	42023017905
Buprenorphine SR	ZooPharm
Calcium Sulfate	CB Minerals		Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub	Patterson Veterinary	07-888-4598
Chloroform	Fisher-Scientific	C298-4
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8503
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248
Ear Vein Catheter	Patterson Veterinary	SR-OX165	Surflo IV catheters
Endotracheal tube	Patterson Veterinary		Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer	Amazon	B001A67WH2	Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips	McKesson Medical-Surgical	788222	Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire	Boston Scientific	39122-01
Hair Clippers	Amazon	B000CQZI3Q	Oster #40 blade
Heating Pad	Cincinnati Subzero	273
Heating Pad Pump	Gaymar		Gaymar T/Pump
Hemostat	Fine Science Tools	13009-12	Curved Mosquito Hemostat
Heparin	Patterson Veterinary
Insertion Tool	Merit Medical Systems	MAP550	metal wire insertion tool
Insulin	HPB Pharmacy		Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes	McKesson Medical-Surgical	942674
Introducer	Cook Medical	G28954	3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane	Henry Schein Medical	1100734
Ketamine	Patterson Veterinary	856440301
Lactated Ringers	McKesson Medical-Surgical	186662
Lidocaine	McKesson Medical-Surgical	239936
Lidocaine/Prilocaine cream	McKesson Medical-Surgical	761240
Ligaloop	V. Mueller	CH117 / CH116	White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil	Amazon	B0049IIVCI
Medrad Syringe	McKesson Medical-Surgical	346920	150 mL
Meloxicam	Patterson Veterinary
Metal ball sutures	Ethicon-Johnson & Johnson	K891H	4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors	Fine Science Tools	14019-13
Midazolam	Henry Schein Medical	1215470
Nitroglycerin	McKesson Medical-Surgical	927528
PECAM Antibody	Novus Biologicals	NB600-562	Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump	Masterflex
Pigtail Catheter	Merit Medical Systems	1310-21-0053	3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture	McKesson Medical-Surgical	129271	4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture	McKesson Medical-Surgical	129031	4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture	Butler	7233-41	3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture	McKesson	104373	4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa)	LabDiet	5321
Rabbit Restrainer	VWR	10718-000
Rib Cutters	V. Mueller
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10015-00	#15 blade
Silk Sutures	Ethicon-Johnson & Johnson	A183H	4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball	McMaster-Carr	1598K23	3-mm diameter
Surgical Drapes	Gepco	8204S
Syringe Pump	DRE Veterinary		Versaflow VF-300
Visipaque contrast media	McKesson Medical-Surgical	509055
Weitlaner Retractor	Fine Science Tools	17012-13