Summary

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Basit bir ATP ölçme tahlil ve canlı/ölü boyama yöntemi ölçmek ve Neisseria gonorrhoeae hayatta kalma ceftriaxone ile tedaviden sonra görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı herhangi bir antibiyotik antimikrobiyal etkilerini incelemek için genişletilmiş ve minimum inhibitör konsantrasyonu antibiyotik bakteriyel biyofilmler tanımlamak için kullanılır.

Abstract

Antibiyotik dirençli Neisseria gonorrhoeae (GC) ortaya çıkması bir dünya çapında sağlık tehdidi ve tedavi başarısız bireyler belirlemek gerektiğini vurgulamaktadır. Bu gram-negatif bakteri bel soğukluğu sadece insanlarda neden olur. Enfeksiyon sırasında form toplamları ve/veya biyofilmler yapabiliyor. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi için antibiyotik duyarlılık belirlemek için ve uygun tedavi tanımlamak için kullanılır. Ancak, içinde vivo ortadan kaldırılması ve laboratuvar sonuçları ile ilişkisi mekanizmasının bilinen değil. Nasıl GC toplama antibiyotik duyarlılık etkiler ve toplam boyutu ve antibiyotik duyarlılık arasındaki ilişkiyi gösterir inceliyor bir yöntem geliştirildi. GC toplamak, antibiyotik öldürmeye daha dayanıklı oldukları zaman, bakteri merkezi ile ceftriaxone tedavi daha iyi daha fazla çevre olan hayatta kalmak için. Verileri N. gonorrhoeae toplama standart agar plaka tabanlı mikrofon yöntemleri kullanarak yansıtılmamış ceftriaxone onun duyarlılık azaltabilir gösterir. Bu çalışmada kullanılan yöntem araştırmacılar bakteri duyarlılık klinik koşullarda test etmek izin verir.

Introduction

Bel soğukluğu ortak bir cinsel enfeksiyon (STI)1iletilen olduğunu. Neisseria gonorrhoeae (GC), gram-negatif bir diplococcal bakteri bu hastalık hastalığının olduğunu. Genital enfeksiyonu belirtileri ağrı idrara çıkma, genelleştirilmiş genital ağrı ve üretral akıntı sırasında neden olabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik2,3,4,5ve bu genişletilmiş kolonizasyon için sağlar. Bunlar tedavi edilmezse hastalık iletim organizmanın kolaylaştırmak için potansiyel var ve bu Pelvik inflamatuar hastalığa (PID) gibi komplikasyonlara yol açabilir ve dissemine Gonokokal Enfeksiyon (DGI)6gibi büyük sağlık kaygı vardır. Antibiyotik dirençli bel soğukluğu önemli halk sağlığı kriz ve artan bir sosyo-ekonomik yük7var. Sefalosporinler düşük duyarlılık tedavi rejimi değişikliğinden tek bir antibiyotik azitromisin veya doksisiklin ceftriaxone8ile birleştiren çift terapisi, sonuçlandı. Ceftriaxone ve Azitromisin9,10, asemptomatik enfeksiyondan ile birlikte artan başarısızlık bel soğukluğu tedavisi hataları anlama gereğini vurgulamaktadır.

Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri, dahil olmak üzere minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi bir antibiyotik direnç tanımlamak için standart tıbbi test olarak kullanılmıştır. Yine de, mikrofon test bakteriyel antibiyotik direnci içinde vivo yansıtır Eğer belli değildir. Bakterilerin antibiyotik bakteri yok edici konsantrasyonları huzurunda yaşama bakteriyel biyofilmler oluşumuna katkıda: mikrofon test bu etkisi11algılayamadı. GC biyofilmler mukozal yüzeyler12tarihinde oluşturabilir çünkü biz o antibiyotik broşürüne duyarlılık toplamları içinde bireysel GC içinde görülen farklı olurdu. Ayrıca, çalışmalar üç değişken yüzey molekülleri, Pili, opaklık ilişkili protein (Opa) faz ve arası bakteri etkileşimleri düzenleyen, lipooligosaccharides (LOS), farklı büyüklükte toplamları13için, yol göstermiştir 14 , 15. katkı antibiyotik direnci için bu bileşenlerin uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle muayene değil.

Şu anda biyofilm ortadan kaldırılması ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. En çok kullanılan nicel biyokütle kristal16boyama violet kullanarak değişiklikleri ölçerek yöntemidir. Ancak, yöntem potansiyel olarak deney tekrarlar17‘ hatalara neden olabilir önemli deneysel manipülasyon gerektirir. Burada kullanılan canlı/ölü boyama yöntemi canlı ve ölü bakteriler ve biyofilm içinde dağılımını görselleştirme sağlar. Ancak, biyofilm yapısı boya penetrasyon azaltır fiziksel bir engel olarak oluşturabilir. Bu nedenle, bir grup içindeki canlı/ölü bakteriler ölçmek için boyama küçük biyofilmler veya onun öncü-microcolonies veya toplamalardan sınırlıdır. Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri de dahil olmak üzere diğer yöntemleri toplama etkilerini ölçmek mümkün değildir. GC duyarlılık toplama sonra antibiyotik pozlama, ideal bir yöntem içinde her ikisi için ölçebilen bir nicel tahlil bakteriler yaşamak ve onların dağılımını görselleştirmenizi incelemek için.

Burada açıklanan yordamı bir ATP-kullanımı ölçüm birleştirir ve Canlı/Boyama ölü bir nicelik tahlil ve GC duyarlılık toplamları antibiyotik varlığında içinde görsel olarak inceleyin.

Protocol

1. genel bakım GC suşları N. gonorrhoeae suşları çizgi GCK agar % 1 Kellogg18 (Tablo 1, tablo 2) derin dondurucu stokları takviyeleri ve 37 ° C % 5 CO2 16-18 h. kullanım MS11 faz-değişken Opa (MS11Opa +), hiçbir Opa (MS11ΔOpa), ifade için kuluçkaya veya kesilmiş LOS (MS11ΔLgtE). Dikkatlice pili negatif (koloni karanlık kenarı olmayan) veya pozitif (koloni karanlık kenarı ile) kolonilerin koloni morfolojisi<sup class="xre…

Representative Results

İki yöntem istihdam: bir ATP kullanımı tahlil ve canlı/ölü boyama tahlil. Sonuçları birlikte veya ayrı ayrı toplamları içinde bakteriyel yaşam antibiyotik tedavisinden sonra incelemek için kullanılır. ATP kullanımı tahlil S. aureus biyofilmler20,21doğru canlı bakteri ölçmek için gösterilmiştir. Burada, MS11Opa + Pil + zorlanma GC toplama rolü antibiyotik duyarlılık incelemek için kullanıldı…

Discussion

Bakteri biyofilmler insan vücudu enfeksiyon sırasında oluşabilir. Geleneksel mikrofon test bir biyofilm bakteri ortadan kaldırmak için gerekli toplama yansıtmaz. Bir biyofilm antimicrobials etkileri test etmek için yanı sıra biyofilm biyokütle esaslı CFUs kaplama yöntemleri biyofilm yapı etkisi nedeniyle hatalı olabilir. Örneğin, kaplama yöntem biricik inşaat eğer biyofilm bozulur. Bu nedenle, elde edilen CFU canlı bakteri gerçek sayısından daha düşük olabilir. Görüntülenmesi ölü ve canlı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü teşkilat ve WS AI123340 için bir hibe tarafından desteklenmiştir. L.-CW, JW, A.C., ve E.N. bölümü/Maryland Üniversitesi tarafından finanse edilen “birinci sınıf yenilik & araştırma deneyimi” programına katılmak içinde desteklenen. Fon yayımlamak için çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. UMD CBMG Imaging Core tüm mikroskobu deneyler için anıyoruz.

Materials

100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

References

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

View Video