Kvantitativ undersökning av antibiotikakänsligheten hos Neisseria gonorrhoeae aggregat använder ATP-utnyttjande kommersiella analyser och Live/Dead färgning
Summary
En enkel mätning av ATP-analysen och live/dead färgning metod användes för att kvantifiera och visualisera Neisseria gonorrhoeae överlevnad efter behandling med ceftriaxon. Detta protokoll kan utvidgas till att undersöka de antimikrobiella effekterna av alla antibiotika och kan användas för att definiera den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika i bakteriell biofilm.
Abstract
Uppkomsten av antibiotikaresistenta Neisseria gonorrhoeae (GC) är en världsomspännande hälsorisk och belyser behovet av att identifiera individer som misslyckas behandling. Denna gramnegativa bakterie orsakar gonorré uteslutande hos människor. Under infektion är det kunna bilda aggregat eller biofilmer. Det minsta hämmande koncentrationen (MIC) testet används för att fastställa känslighet för antibiotika och fastställa lämplig behandling. Mekanismen av utrotning i vivo och dess relation till laboratorieresultat är dock inte kända. En metod som undersöker hur GC aggregering påverkar Antibiotikakänslighet och visar förhållandet mellan sammanlagda storlek och Antibiotikakänslighet utvecklades. När GC samlade, de är mer motståndskraftiga mot antibiotika dödande, överlevande med bakterier i stadens ceftriaxon behandling bättre än de i periferin. Data visar att N. gonorrhoeae aggregation kan minska dess känslighet för ceftriaxon, vilket inte speglas med standard agar plattan-baserade MIC metoder. Den metod som används i denna studie gör att forskare att testa bakteriell känslighet under kliniskt relevanta förhållanden.
Introduction
Gonorré är en gemensam sexuellt överförbara infektioner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en gramnegativa diplococcal bakterie, är vilka smittämnen av denna sjukdom. Symtomen vid genital infektion kan leda till smärta vid urinering, generaliserad genital smärta och urinrörets ansvarsfrihet. Infektionen är ofta asymtomatiska2,3,4,5, och Detta tillåter för utökade kolonisering. Dessa obehandlade infektioner är ett betydande hälsoproblem, eftersom de har potential att underlätta överföring av organismen och detta kan leda till komplikationer såsom inflammatoriska sjukdomar (PID) och spridas uretra infektion (DGI)6. Antibiotikaresistenta gonorré är en större folkhälsokris och en ökande socioekonomisk börda7. Minskad känslighet för cefalosporiner har resulterat i behandlingsregim förändring från en enda antibiotika till dubbla terapi, som kombinerar azitromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon och azitromycin9,10, i kombination med asymtomatiska infektioner, ökad misslyckande belyser behovet av förståelse gonorré behandling misslyckanden.
Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) test, inklusive agar utspädning och skiva diffusion tester, har använts som standard medicinsk test för att identifiera motstånd mot ett antibiotikum. Det är dock oklart om MIC testet återspeglar bakteriell antibiotikaresistens invivo. Bildandet av bakteriell biofilm bidrar till överlevnaden av bakterier i närvaro av bactericidal koncentrationer av antibiotika: MIC testning är inte upptäcka denna effekt11. Eftersom GC kan bilda biofilmer på slemhinnorna12, vi hypotes att antibiotika känslighet inom aggregat skulle vara annorlunda än sett i enskilda GC. Dessutom, har studier visat att trefas variabel yta molekyler, Pili, opacitet-associerade protein (Opa), och lipooligosaccharides (LOS), som reglerar mellan bakterien interaktioner, leda till olika storlek aggregat13, 14 , 15. bidraget av dessa komponenter till antibiotikaresistens har inte undersökts på grund av avsaknaden av lämpliga metoder.
För närvarande finns det flera metoder att mäta biofilm utrotning. Den mest använda kvantitativa metoden är genom att mäta förändringar i biomassa med hjälp av kristallviolett färgning16. Metoden kräver dock betydande experimentella manipulation, som potentiellt kan generera fel i experimentet upprepas17. Den live/dead färgningsmetod som används här tillåter visualisering av levande och döda bakterier och deras fördelning inom biofilmen. Dock kan biofilm struktur posera som en fysisk barriär som minskar dye penetration. Därför, för att kvantifiera live/dead bakterier inom en grupp, färgningen är begränsad till små biofilmer eller dess föregångare-microcolonies eller aggregeringar. Andra metoder, inklusive agar utspädning och skiva diffusion testerna, är inte kunna mäta effekterna av aggregering. För att undersöka GC känslighet inom aggregering efter antibiotika exponering, en idealisk metod skulle måste för att ha både en kvantitativ analys som kan mäta levande bakterier och visualisera deras fördelning.
Proceduren som beskrivs här kombinerar en ATP-utnyttjande-mätning och en live/dead färgning assay att kvantitativt och visuellt undersöka GC känslighet inom aggregat i närvaro av antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterier kan bilda biofilmer under infektion av den mänskliga kroppen. Traditionella MIC tester kanske inte återspeglar den koncentration som behövs för att utrota bakterier i en biofilm. För att testa antimikrobiella effekter på en biofilm, kan metoder baserade på biofilm biomassa samt plätering CFUs vara felaktiga på grund av effekterna av biofilm struktur. Till exempel fungerar plätering metoden bara om biofilmen kan störas. Den CFU erhålls kan därför vara lägre än det faktiska antalet livskraftiga ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett stipendium från National Institute of Health att D.C.S. och W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., och E.N. stöddes i del/delta i ”The första årets Innovation & forskning Experience”-programmet finansieras av University of Maryland. Finansiärerna hade ingen roll i studie design, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra, eller beredning av manuskriptet. Vi erkänner UMD CBMG Imaging kärnan för alla mikroskopi experiment.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
