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Summary
여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.
Abstract
새로운 분석 방법 긴급 한 놀라운 opioid 처방전 약물 위기와 공중 보건에 주어진 높은 처리량, 아직 포괄적인 약물 검사 수 있도록 필요 합니다. 가스 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (GC-MS/MS) 다음 기존의 소변 마약 테스트 기반 2 계층 immunoassay 화면 또는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 메서드는 비싸고 바이어스 하는 경향이 있는 동안 학대 (DoA)의 알려진된 약물의 타겟된 패널에 제한 됩니다. 여기, 우리는 멀티 사출 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 (MSI-CE-MS)를 사용할 때 해상도 DoA와 그들의 대사 산물의 확장 된 패널의 검출에 대 한 수 마약 감시에 대 한 개선된 방법 개요. 전체 스캔 데이터 수집을 사용 하 여 시간-의-비행 id에 대 한 긍정적인 이온 모드 감지에서 질량 분석기 (TOF-MS) 수와 함께에서 ce (< 3 분/샘플) 품질 관리와 함께 10 개의 소변 샘플의 분판 다중화와 위의 DoA의 정량화 커트 오프 수준을 권장합니다. 약물이 성체 및 분포, 배경 간섭 등의 우수한 해상도 어디에 정확한 샘플 세그먼트 사이 electrokinetic 스페이서와 MSI-CE-MS를 사용 하 여 달성 된다의 comigration 함께 질량/분자 수식 한 내부 표준 및 하나 검색 deuterated 일치 하거나 더 많은 바이오 변형 metabolites 넓은 탐지 창 DoA 식별을 용이 하 게 합니다. 또한, 소변 샘플은 복잡 한 샘플 검사 결과 없이 빠른 심사에 대 한 효소 deconjugation 하지 않고 직접 분석할 수 있습니다. MSI-CE-MS 수 있습니다 처방된 약물 준수 확인, 불법 마약 사용/대체, 공개 및 최적의 복용량 정권 평가 포함 하 여 위험이 높은 환자의 치료 모니터링에 필요한 DoA의 광범위 한 스펙트럼의 감시를 정밀 의학의 새로운 발전을 위해 필요에 따라.
Introduction
오용 및 만성 통증 관리를 위한 opioids에 중독에 놀라운 증가 나타냅니다 70000 약물 과다 사망 20171에서 예상 하는 미국에와 공중 보건에 성장 위협을. 마찬가지로, 다른 다양 한 정신 약물 또한 널리 어린이 불안, 우울증, 그리고 정신 건강 문제2의 치료에 대 한 젊은 성인에 게 처방 됩니다. 그 결과, 소변 마약 검사 방법, 직장 및 법정 독물학, 널리 개발 포용 력 및 의존3,4경향이 있는 처방된 약물 치료 모니터링에 중요 한 중요성 이다. 이 잠재적인 대체, 불법 또는 nonprescribed 약물 오용 등을 공개 하면서 준수, 최적의 치료 효능과 환자 안전 보장 하기 위해 필요 합니다. 소변 약물 검사 사망에 대 한 2 계층 접근 방식에 의존 하는 현재는 초기 경쟁 immunoassay 화면 통해 이루어진 포인트의 케어 장치 또는 실험실 분석기, 뒤 확실 한 테스트를 큰 GC-MS/MS를 기반으로 그리고, 점점, LC-MS/MS5. 그러나, immunoassays는 경향이 편견, 항 체 약 바인딩할 nonspecifically 다양 한 약물 클래스는 신뢰할 수 있는 식별 및 특정 약물 또는 복잡 한 약물의 정량화 추정 화면-긍정적인 결과 생성 하 혼합물의6. 이러한 맥락에서 더 정확한 소변 약물 검사의 포괄적인 polydrug 화면7 디자이너 약물을 포함 하 여 엄청난 비용을 감안할 때 필요한 긴급 하 고 합성 소변 제품 기존의 것 들을 대상으로 분석 합니다.
함께 고해상도 MS (HRMS) 또는 orbitrap TOF 질량 분석기를 사용 하 여 높은 효율 분판 polypharmacy와 DoA8,9 패널 확장의 시대에 마약 감시를 위한 nontargeted 전략으로 제안 . 그러나, 기존의 LC 분판 느린 (> 15 분) 때문에 긴 차입 시간 해상도 대 한 화학적으로 다양 한 클래스의 DoA의 및 그들의 대사 산물을 사용 하 여 그라데이션 차입 프로그램, 정기 마약 검사에 대 한 샘플 처리량을 제한 하는. 또는 직접 분석 방법을 탈 착 이온화 (DESI)10 에 따라 하 고 레이저 다이오드 열 탈 착 (LDTD) 분리11없이 심사 빨리 마약에 대 한 허용. 그러나, 이러한 주변 이온화 방법 복잡 한 소변 표본, 따라서 독립적인 확인 테스트 요구를 분석할 때 isobaric/이성질체 방해 하는 경향이 있다.
우리 연구소는 최근 MSI-CE-MS12에 따라 고효율 분리의 해상도 데이터 충실도 유지 하면서 샘플 처리량 증가를 다중화 분리 플랫폼을 개발 했다. 새로운 데이터 워크플로 디자인 될 수 있다 MSI-CE-MS에서 볼륨 제한 biospecimens의 (즉, metabolomics) 프로 파일링 nontargeted 대사 산물에 대 한 품질 컨트롤 (QC) 대규모 인구에 필요한 일괄 수정에 대 한 허용 하는 반면 연구13. 이 경우에, 분판 단일 내에서 10 개 이상의 샘플의 직렬 주사 수 있는 기존의 칼 집 액체 인터페이스를 사용 하는 경우 정상 용 매 조건 하에서 발생 하는 용 질 이온화와 isocratic 버퍼를 사용 하 여 수행 됩니다. DoA와 그들의 대사 산물14의 다양 한 클래스의 급속 한 아직 선택적 심사에 대 한 실행 합니다. 이 연구의 초점은 더 MSI-CE-MS 효소 가수분해15에 대 한 필요성을 피할 수 "희석-와-쏴" 방법을 사용 하 여 임상 우울증 환자의 대표적인 일대에서 본격적인 소변 샘플의 직접 분석에 대 한 유효성을 검사 하. 또한, MSI-CE-MS16 직렬 샘플 플러그 사이 electrokinetic 스페이서의 구현 더 다양 한 약물이 성체/분포의 해상도 개선, 요도 방해 배경 수행 및 크로스-간섭 DoA의 대형 패널을 검사 하는 경우. 내부 표준 deuterated 일치를 사용 하는 경우 소변 표본에서 DoA의 절대 정량화 (d-는) MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 설명 된다. 이 방법은 또한 화면-긍정적인 경우에 권장 약물 패널 혼합물에 비교 될 때의 올바른 샘플 위치 추론 뿐만 아니라 마약 식별 용이 하 게 심사 마감 수준 내에서 내부 참조/QC도 작동 같은 실행 합니다.
Protocol
멀게 소변 샘플 친절 하 게 그의 연구는 해밀턴 통합 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 세인트 조셉의 병원 (해밀턴, 캐나다), 기분 장애 클리닉에서 박사 자 Samaan에 의해 제공 되었다.
1. 시 약 및 샘플 솔루션 준비
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배경 전해질 준비
- 배경 전해질 (BGE) 격주, 1 M 개미의 산 성, pH 1.8, 유기 한정자로 15 %v / v 이기와 50 mL를 준비 합니다.
- aliquot 1.9 mL 50 mL 부피 플라스 크에 포 름 산 주식 (26.5 M)를 집중 하 고 7.5 mL 이기와 40.6 mL 50 ml 전체 볼륨을가지고 이온된 수의를 추가 합니다. 그런 다음, 15 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 꽉 밀봉과 소독된 한 병에 그것을 전송.
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칼 집 액체 준비
- 칼 집 액체 솔루션의 매주 0.1% 개미 산 성과 (MeOH:H2O)에 구성 된 200ml를 준비 합니다.
- Aliquot 200 µ L 120 mL MeOH와 H2O 칼 집 액체와 15 분 동안 드의 80 mL를 포함 하는 병으로 포 름 산 (26.5 M 주식)의.
- 다음 각 다음 참조 이온, 퓨 린 및 hexakis의 10 µ L를 추가 (2,2,3,3 tetrafluoropropoxy) m에 지속적인 대량 신호를 제공 하기 위해 칼 집 액체에 (HP-921), phosphazine /z 121.05087와 m/z 922.00979, 각각.
참고: 이러한 참조 이온 실시간 대량 수정에 대 한 허용 하 고 또한 분리 하는 동안 잠재적인 매트릭스 유도 이온 억제 또는 향상 효과 대 한 모니터링.
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표준 준비
- 임상 심사 컷오프 x 3에 84-마약 패널 혼합물 화학 공급 업체에서 구입한 약물 표준을 사용 하 여 메탄올의 1 ml에서 (L6)14 레벨을 포함 하는 표준 솔루션을 준비 합니다. 메탄올의 1 mL에 84-약물 혼합 보다 10 높은 농도에서 deuterated 내부 마약 표준 (d-ISs) 일치 하는 48의 혼합물을 별도로 준비 합니다. 또한, 4의 200 µ M를 포함 하는 재고 솔루션을 준비-플 루 오로-L-페닐알라닌 (F-페)와 3-클로-L-티로신 (Cl-Tyr) 이온된 H2o.의 1 mL에
- 4-fluorophenylalanine (F-페, 10 µ L) 및 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µ L) 총 수 있도록 인증된 합성 소변 매트릭스 (40 µ L)의 10 배 희석 뿐만 아니라 위에서 언급 한 84 약물 혼합 (20 µ L)와 48 d-ISs (20 µ L), 오부 희석을 수행 250 µ L 원심 분리기 튜브에서 100 µ L의 볼륨.
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외부 교정 곡선 준비
- 준비 5-포인트 외부 보정 곡선 (아래 설명 참조) quadruplicate에서 (n = 4) 84-마약 표준 혼합물 및 단계 1.3.1에서에서 만든 그들의 해당 d ISs의 48를 사용 하 여 20-fold 동적 범위. 예를 들어 5-포인트 외부 보정 곡선을 만들기 위한 2-, 4-, 10-, 20-84-마약 혼합물 (L6, 단계 1.3.1) diluting 확인 및 40-fold, d-ISs (20 µ L) 및 4-F-페 (10 배 희석의 오부 희석을 준비 해야 하는 반면 10 µ L) 및 Cl Tyr (10 µ L) 100 µ L의 총 볼륨을 합성 소변 매트릭스에 추가입니다. 경우에서 일치 하는 d는 특정 약물에 대 한 사용할 수 없는 경우 데이터 정규화에 대 한 사용 4-F-페 대리로 이다.
참고: 방지 크로스 방해 추가 d-ISs의 포함 (isobaric) 그들은 완전히 해결 되지 CE 분리 하는 경우 패널 내에서 다른 DoA와.
- 준비 5-포인트 외부 보정 곡선 (아래 설명 참조) quadruplicate에서 (n = 4) 84-마약 표준 혼합물 및 단계 1.3.1에서에서 만든 그들의 해당 d ISs의 48를 사용 하 여 20-fold 동적 범위. 예를 들어 5-포인트 외부 보정 곡선을 만들기 위한 2-, 4-, 10-, 20-84-마약 혼합물 (L6, 단계 1.3.1) diluting 확인 및 40-fold, d-ISs (20 µ L) 및 4-F-페 (10 배 희석의 오부 희석을 준비 해야 하는 반면 10 µ L) 및 Cl Tyr (10 µ L) 100 µ L의 총 볼륨을 합성 소변 매트릭스에 추가입니다. 경우에서 일치 하는 d는 특정 약물에 대 한 사용할 수 없는 경우 데이터 정규화에 대 한 사용 4-F-페 대리로 이다.
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소변 샘플 준비
- Deidentified 아침 소변 샘플 알려진된 처방전 약 역사 10 임상 우울증 환자의 대표적인 코 호트에서 녹여 그들은 분석에 대 한 해 동 할 때까지-80 ° C에서 소변 샘플 수집 후 저장 합니다.
참고: 여러 freeze-thaw 주기를 소변 또는 특정 사망 대사 산물 그리고 그들의 어원이 같은 말의 화학 안정성에 미치는 영향으로 인해 컬렉션 다음 실 온에서 지연된 저장 하지 마십시오. - 소용돌이 deidentified 아침 소변 샘플 30 s 고, 다음, 침에 대 한 14000 x g 에서 1 분 동안 원심. 그 후, 위에서 언급 한의 aliquot 10 µ L 처리 소변, 10 µ L d의-, 그리고 이온 H2O, 그리고 1 분에 대 한 소용돌이의 F-페/Cl-Tyr와 25 µ L의 5 µ L (기술적인 정밀도 평가 하기 위해 3 중에이 단계를 반복 하는). 분석에 대 한 폴 리 프로필 렌 유리병을 위에 설명 된 혼합물의 20 µ L 약 수를 전송 합니다.
- Deidentified 아침 소변 샘플 알려진된 처방전 약 역사 10 임상 우울증 환자의 대표적인 코 호트에서 녹여 그들은 분석에 대 한 해 동 할 때까지-80 ° C에서 소변 샘플 수집 후 저장 합니다.
2. CE TOF MS 시스템의 설치
- 매개 변수를 조절 하는 비 코팅된 융합 된 실리 카 모 세관
- 모든 표준, 외부 보정 곡선, 그리고 소변 샘플 섹션 1.3-1.5에서 50 μ m, 360 µ m의 외부 직경의 내부 직경이 uncoated 오픈 관 융합 된 실리 카 코팅 구체의 모 세관을 사용 하 여 분리 되어 있는지 확인 및 총 모 세관 길이 135 cm입니다.
참고: 다이아몬드 커터 도구 플러시 및 부드러운 컷을 보장 하기 위해 검사 더 일관 된 모 세관을 보장 하기 위해 사용 됩니다. - 모두 말 초 모 세관 끝에서 잠재적인 구체의 유기 용 매와 접촉 하면 붓기를 방지 하는 모 세관 창 메이커 샘플 이어지기를 줄이기 위해 사용 하 여 폴 리 이미 드 코팅의 약 7 m m를 제거 합니다.
- CE 분무기 바늘에서 모 세관 출구의 약 2 mm를 내 다 고 두 360 ° 회전을 반복 하 여 CE 카트리지에서 모 세관 입구를 설치 해야 합니다. 그럼, 신중 하 게 CE에 CE 카트리지를 설치 하 고 모 세관을 컨디셔닝 때 이온 소스에서 CE 분무기를 배치.
참고: 컷 그것으로 일관 되 게 모 세관 출구 현재 MS에 결합 될 때 안정적인 분무 보장 위해 결정적 이다. 두 개의 다른 스프레이이 작품에서 사용 되었다: CE 분무기 샘플 분석을 위해 사용 되었다 그리고 LC 분무기 대량 캘리브레이션에 사용 되었다. - 이온 소스에 배치 되지 CE 분무기와 컨디셔닝 모 세관을 수행할 수 있는지 확인 합니다. LC 분무기 이온 소스에 넣어.
참고:이 이후에 TOF MS에 결합 하는 동축 칼 집 액체 인터페이스의 어떤 오염 든 지 피하고 있는 동안 대량 교정할 수 있습니다. - 악기를 제어 하 고 다음 순서에 따라 4 개의 다른 용 매에 대 한 각 30 분에 플러시의 지속 시간을 설정 하는 데 사용 하는 공급 업체의 소프트웨어에 플러시 기능 (940 mbar)를 선택 하 여 새로운 모세 혈관을 조건: 메탄올, 1 M NaOH, 이온된 물, 그리고 BGE입니다. 모 세관 조절 기간 동안 대기에서 isocratic 펌프를 넣어 있는지 확인 합니다.
- CE-MS 분무기 MeOH/H2O 어떤 잔여 소금 예금을 제거 하에 배어 조직 닦아 닦아.
- 샘플을 분석 하기 전에 CE-MS 시스템의 일일 예방 유지 관리를 수행 합니다. 메탄올을 사용 하 여 CE 전극 (입구)의 아래로 닦아 하지만 소 프로 파 놀을 사용 하 고 물 청소 소금 형성을 방지 하 고 잠재적인 샘플 수행을 제한 하는 것이 중요 하다는 CE MS 인터페이스 (50: 50) 혼합물.
- 이온 소스에서 LC 분무기를 제거 하 고 CE MS 동축 칼 집 액체 인터페이스에 새로 에어컨된 모 세관으로 청소 스프레이 위치.
- Isocratic 펌프를 켜고 30의 전압을 적용 안정적인 CE 현재 프로필 소변 분석 전에 달성 되도록 15 분 kV.
- 모든 표준, 외부 보정 곡선, 그리고 소변 샘플 섹션 1.3-1.5에서 50 μ m, 360 µ m의 외부 직경의 내부 직경이 uncoated 오픈 관 융합 된 실리 카 코팅 구체의 모 세관을 사용 하 여 분리 되어 있는지 확인 및 총 모 세관 길이 135 cm입니다.
- CE를 사용 하 여 주입 및 분리 상태
- CE 매개 변수를 설정 하 고 선택 하는 단계를 거치기에 악기를 제어 하기 위한 사용 하는 공급 업체 소프트웨어를 엽니다. 설정 기능을 플러시 600의 BGE 유리병 위치를 지정 하 고.
참고: 외부 물 냉각기로이 볼륨 제한 샘플의 대규모 배치를 분석할 때 샘플 증발을 방지 하는 데 필요한 샘플 트레이 기능, 냉각 부족 CE 시스템에 연결 해야 합니다. - Hydrodynamically 5 100 mbar에서 샘플을 주사를 주입 기능 설정 s electrokinetically 30 BGE 스페이서를 삽입 하 고 75 k v s.
참고:이 프로세스 (다른 유리병 위치)에서 총 11 이산 샘플 분석 소프트웨어에 방법 프로그램 내에서 자동으로 수행 되는 (동일한 유리병 위치)에서 BGE 공백 뒤 각 샘플 주입이 반복 되는 같은 때 MSI 형식을 사용 하 여 실행 합니다. 10 소변 샘플을 분석 심사 마감에 84-패널 약물 혼합 후 임의의 순서로 수준 각 MSI-CE-MS 실행에 대 한 첫 번째 샘플 위치도 주입. - 설정 하는 전압을 적용 30 kV, 25 ° C, 및 총 런타임 카트리지 온도 시간표를 사용 하 여 40 분 적용 2min mbar의 압력 기온 변화도 0 분에서 40 분을 분리 하는 동안.
참고: 그라디언트 압력 일부 약하게, 기본적인 benzodiazepines 포함 느린 마이그레이션 약물과 중립/산 성 약물 (예를 들어, 아 세트 아미노 펜, 바비 투르)의 차입에 대 한 허용 하도록 분리 하는 동안 적용 됩니다. 그러나, 가장 기본적인 DoA와 그들의 대사 산물 암페타민, opioids, 그리고 알 카 로이드의 다른 클래스를 포함 하 여 25 분 이내 양이온으로 마이그레이션합니다. - 샘플 수집을 완료 한 후 다음 날까지 BGE와 낮은 압력 (50 mbar)에 모 세관을 씻어 있는지 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 린스 600 모 세관 높은 압력 (900 mbar) 물으로 그리고 600 s s 공기, 다음 사용 때까지 분무기 홀더에 저장.
- CE 매개 변수를 설정 하 고 선택 하는 단계를 거치기에 악기를 제어 하기 위한 사용 하는 공급 업체 소프트웨어를 엽니다. 설정 기능을 플러시 600의 BGE 유리병 위치를 지정 하 고.
- Isocratic 펌프와 액체 칼 집
- CE-MS 분무기에 10 µ L/min의 속도로 칼 집 액체 (0.1 %v / v 포 름 산과 MeOH:H2O)를 제공 하는 인피니티 Isocratic 펌프와 무한대 Degasser를 사용 합니다.
- TOF-MS 설정
- TOF-MS, 동축 칼 집 액체 분무 이온 소스와가 열 된 질소 가스는 CE 장치를 갖추고 있는지 확인 합니다.
- 긍정적인 이온 탐지 를 m의 질량에서 TOF MS 운영 /z 50-1700, 데이터 수집 속도 500 ms/스펙트럼의. 되도록 프로필 및 중심 데이터 ".d" 파일 형식으로 저장 됩니다.
- 되도록 분무 이온화 조건 설정: Vcap 및 노즐 2000 V 전압, 10 psi에 분무기 가스 건조 가스 배달 195 ° c.에 3.5 L/min의 칼 집 가스 흐름 300 ° C에서 8 L/분 또한, MS 전압 설정을 설정 fragmentor, 제비 갈매기, 그리고 Oct1 RF의 120, 65, 및 750 V, 각각.
참고: 분무기 가스 뿐 아니라 Vcap 및 노즐 전압 설정이 해제 되어 있었고 MSI-CE-MS에서 사용 하는 직렬 샘플 주입 순서 동안 하지만 켜야 다시 1 분 전류를 방지 하기 위해 전기 이동 별거의 개시 후에 분무 짜여졌다 오류 suctioning 효과 때문입니다. - 공급 업체의 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인스트루먼트 컨트롤 및 데이터 수집을 수행 합니다.
- 데이터 분석
- MSI-CE-MS 데이터 처리, 데이터 스무 딩, 그리고 대표 사망에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIEs)의 통합 및 그들의 대사 산물을 포함 한 공급 업체의 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
- 소프트웨어를 열고 다음 매개 변수를 설정 합니다.
- Chromatograms에서 추출 데이터 형식, 그리고 프로 파일 모드에 크로마와 질량 스펙트럼 데이터 포맷 을 선택 합니다.
- 이차/큐빅 Savitzky Golay 다듬기 기능 및 함수 폭 15 포인트를 선택 합니다.
- 다음 통합 (MS)를클릭 합니다 Agile, 되도록 통합 설정 하 고 피크 필터아래에서 가장 큰 11 봉우리 제한의 최대 수를 선택 합니다.
- 보기를 클릭 하 고 통합 피크 목록, 클릭 한 최대 수, 보존 시간 (RT), 피크 면적, 피크 높이및 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 선택 합니다.
- 고유한 메서드 이름 아래 이러한 매개 변수를 저장 합니다. 이 메서드는 프로세스에 적용 하 고 각 데이터 집합을 해석.
참고: 최대 수와 요약 표, RT, 피크 면적 및 높이 및 SNR 오른쪽에 표시 됩니다. 측정 된 RT와 d를 중 하나는 일치 하는 각 사망에 대 한 통합 된 피크 지역에 대 한 데이터 정규화를 수행-은 또는 (해당 되는 경우 사용할 수 없음) F-페 분석 정밀도 향상 시키기 위해.
3. 소변 샘플 및 외부 교정 곡선의 분석
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MSI-CE-MS에서 사용 하는 다른 직렬 주입 구성
- 첫 번째 직렬 샘플 주입 구성, 약물이 성체/동 해상도 (그림 1A)를 설명 하는 데 사용에 대 한 확인 5 주사는 d 84 마약 표준의 혼합물에 수행 반복-는 4-F-페/Cl-Tyr, 뒤는 6 주입, 빈 샘플에에서 있는 합성 소변, 그리고 표준 약물 혼합물의 5 개의 추가 주사.
- 두 번째 직렬 샘플 주입 구성, 알려진된 처방 (그림 2A)를 가진 환자에서 개별 소변 샘플에서 DoA의 탐지를 보여 주기 위해 사용에 대 한 첫 번째 샘플 플러그에 84-마약 표준 혼합물의 혼합물 인지 하는 것을 확인 한 컷오프 심사 수준 (긍정적인 제어) x 1 다음 10 희석된 소변 샘플의 무작위 주사 환자에서: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183, 및 #50.
- 세 번째 직렬 샘플 주입 구성, 단일 실행에서 외부 교정 곡선의 인수를 설명 하는 데 사용에 대 한 사망에 대 한 calibrant 솔루션 20-fold 선형 동적 범위 0.25에 준비가 확인 x, 1 x 0.5 x 2.5 x, 그리고 d-F-페/Cl-Tyr 그리고 합성 소변 매트릭스에 추가 그대로 일치 함께 컷오프 농도 x 5 (n = 4).
Representative Results
MSI-CE-MS의 처리량을 크게 향상 시켜 단일 실행 내에서 10 개 이상의 개별 샘플 직렬 주입 수 있습니다 (< 3 분/샘플) 복잡 한 경 음악 수정, 열 전환 프로그램 또는 비용이 많이 드는 인프라 없이 투자 (그림 1A)입니다. BGE의 샘플의 유체역학 주사와 electrokinetic의 대체 시리즈 이온의 구역 전기 이동 별거 강산 전해질 조건 (pH에서 발생, 한 수정 되지 않은 융합 된 실리 카 모 세관 내에서 수행 1.8). 용액의 이온화도 정상 상태 조건 하에서 발생 합니다. 이 경우 동축 칼 집 액체, 대량 calibrant 사용 됩니다 인터페이스 CE MS에 대 한 최소한의 이온의 억제 또는 강화 효과 대량 calibrant 이온 신호에 의해 모니터링으로 긍정적인 이온 모드 감지 아래. TOF는 MSI-CE-MS를 사용 하는 경우 nontargeted 심사/마약 감시 응용 프로그램에 적합 한 빠른 데이터 수집으로 강력한 아직 비용 효과적인 HRMS를 나타냅니다. 예를 들어 다양 한 isobaric/이성질체 DoA와 3 opioid 구조이 성체, 즉 norhydrocodone, hydromorphone, 그리고 모 르 핀 (그림 1B)의 구조이 성체를 포함 하 여 그들의 대사 산물에 대 한 인상적인 해상도 달성 된다. 이 경우에, 30 해결 마약 혼합물의 10 독립 샘플에서 봉우리 샘플 수행 하지 않고 검색 됩니다. 합성 소변 빈/부정적인 소변 제어 직렬 주입 시리즈 내에서 포함 되어 있습니다 (샘플 위치 #6). 또한, 두 개의 다른 isobaric opioids, 즉 6-acetylmorphine (비활성 헤로인 대사 산물)과 naloxone (한 opioid 수용 체 길 항 근 opioid 약물의 응급 치료를 위해 사용) 전체 스캔 데이터 수집 (20 가지 봉우리로 완벽 하 게 해결 됩니다. 그림 1C)입니다. 마찬가지로, 두 암페타민 위치이 성체 MSI-CE-MS phentermine, 체중 감소 식욕 억제제로 사용 되는 처방된 자극 제의 잠재적인 오용 불법 메 담 페타 민 남용 구별에 완벽 하 게 해결 됩니다.
그림 1: 시리즈의 대표적인 사망이 성체/분포 10 샘플 및 단일 실행 내 빈을 분석 하 여 MSI-CE-MS에 의해 해결에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE). (A) 회로도의 MSI-CE-MS 합성 소변에 84-DoA 패널 사용 하는 직렬 주입 구성을 나타냅니다. 이 다중화 분리 방법을 사용 하 여 11 이산 샘플 및 빈의 유체역학 주사의 대체 시리즈 버퍼의 electrokinetic 주사와 이온, 전체 스캔 데이터 다음의 구역 전기 이동 별거를 시작 긍정적인 이온 모드 감지 TOF MS에 의해 취득. (B) 3 isobaric 기능 그룹 opioid이 성체 (m/z 286.1438), 세 륨, norhydrocodone, hydromorphone, 그리고 모 르 핀을 포함 하 여 10 개별 샘플 주사에서 30 해결된 봉우리를 구성 하 여 분리. (C) 2 isobaric opioid 약물과 그들의 대사 산물 (m/z 328.1543), ce, 6-acetylmorphine (헤로인 대사 산물) 등 naloxone 10 개별 샘플 주사에서 20 해결된 봉우리로 구성 된 분리. (D) 2 isobaric 기능 그룹 암페타민이 성체, CE, 구분 20 해결된 봉우리 10 개별 샘플 주사, 메 담 페타 민, phentermine 등으로 구성 된. 모든 경우에, 부정적인 소변 컨트롤/공백 MSI-CE-MS는 6 샘플 위치에 소개 샘플 수행의 사소한 증거를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
DoA 검열, MSI-CE-MS에서 직렬 주입 구성 권장에 84-마약 패널 혼합물을 사용 10 대표 소변의 무작위 분석 뒤에 커트 오프 농도 (모든 실행에 대 한 첫 번째 주입 위치)으로 심사 알려진된 처방전 역사를 가진 임상 우울증된 환자에서 샘플. 긍정적인 심사 메타 돈에 대 한 결과 테스트 하는 예를 들어, (m/z 310.2165) 환자에서 #208 (그림 2A) (사출 # 9에서에서 발생 하는) 낮은 메타-d3와 comigrates는 큰 신호 피크의 검출에 의해 추론 오류 질량 (< 5 ppm). 다른 신호는 동일한 실행 내에서 다른 소변 샘플에서 검출 된다. 메타 돈 농도 기준 약 혼합물/QC (사출 #1)와 샘플 (사출 #9)에서 측정 된 이온 응답 비율을 비교할 때 13 배 권장된 마감도 초과 하 고 사중 소변 희석 요인에 의해 수정. 따라서,이 결과 메타 돈 정비 치료는 환자의 준수를 확인합니다. Nonprescribed 암페타민 섭취 (그림 2B)의 증거는 높은 암페타민 수준으로 표시 됩니다 (m/z 136.1121)는만 한 환자 (환자 #50, 주입 # 11에서에서) MSI-CE-MS 실행 내에서 감지 되었다. 측정 된 농도 약간 권장된 컷오프 수준 초과 (1.3 x). 이 암페타민 d5와 comigrates 그리고 상위권 분자 공식 경기와 낮은 대량 오류가 발생 했다. 항우울제 벤라팍신에 대 한 긍정적인 테스트 결과 (m/z 278.2115), 선택적 세로토닌-노르 재흡수 억제제 환자 #281 (사출 #6)에 설명 된다. 이 경우에, 농도 초과 권장된 컷오프 수준 (15 x),이 의해 그것의 정확한 질량 또는 분자 공식-일치, comigrating 벤라팍신-d6 (그림 2C) 함께 식별 됩니다. 후자의 기준의 정확한 질량에 전적으로 의존 하는 경우 주의 대 한 필요성을 강조 하는 EIE 추적 내에서 감지 하는 알 수 없는 동에 대 한 충족 되지. 또한,의 뿐만 아니라 neuropathic 고통의 처리를 위해 소정의 pregabalin의 확실 한 검색 일반화 불안 또한 환자 # 309에 대 한 설명, 권장 위에 그것의 조잡 한 높은 농도 (64 x)에 따라 차단 수준 (그림 2D)입니다. 그러나 그것은,, 하지 감지는 9 다른 환자 소변 샘플 같은 내 분석 실행. 다른 화면-긍정적인 경우와 마찬가지로, #4, 주입 pregabalin-d6, MSI-CE-MS에 의해 분석 하는 모든 소변 샘플에 포함 되어 있는 comigrates.
그림 2: 일련의로 10 임상 우울증 환자의 코 호트에서 대표적인 화면-긍정적인 소변 마약 테스트 결과 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE) 때 권장에 84-마약 패널 MSI-CE-MS를 사용 하 여 확인 차단 수준, 내부 참조/QC로 첫 번째 샘플 주입 위치와 주입. (A) EIE 오버레이 해당 메타 돈-d3, 메타 돈으로 comigrates 하는 단 한 소변 샘플을 강조 (주입 위치 #9) 메타 돈 농도 커트 오프 수준을 초과 상승. (B) EIE 오버레이 암페타민-d3, 암페타민과 comigrates에 그 하나만 소변 샘플을 강조 (주입 위치 #11) 커트 오프 수준 이상의 농도 상승. (C) EIE 그 하나만 소변 샘플을 강조 벤라팍신-d6, 벤라팍신과 comigrates, 해당 오버레이 (주입 위치 #6) 차단 수준 이상의 농도 상승. (D) EIE 그 하나만 소변 샘플을 강조 pregabalin-d6, pregabalin와 comigrates, 해당 오버레이 (주입 위치 #4) 조잡 한 커트 오프 수준을 초과 하는 농도 상승. 모든 소변 샘플 d를 일치의 추가 함께 이온된 수에 오부 희석 후 직접 분석 했다-(사용 가능한 경우)입니다. D-ISs 낮은 대량 오류와 함께 comigrates 약에 해당 하는 MSI-CE-MS에서 화면 양성 결과 (< 5 ppm) 및 그 농도 초과 잘라 내부 참조/QC로 동일한 실행 내에서 분석 하는 정확한 분자 공식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
MSI-CE-MS 외부 교정 곡선에 따라 단일 실행 내에서 빠르게 인수는 DoA에 대 한 참조 calibrant 표준을 사용 하 여 사용 DoA와 그들의 대사 산물의 절대 정량화를 또한 얻을 수 있다. 예를 들어, 직렬 희석 84-약 calibrant 혼합물의 일치 하는 함께 d-에 고정된 농도 복잡 한 소변 샘플에서 신뢰할 수 있는 정량 분석을 제공 합니다. 이 샘플 사이의 모 세관에 주입 볼륨 변화 뿐만 아니라 잠재적인 매트릭스 유도 이온 억제 또는 강화에 대 한 보상. 경우에서 일치 하는 d은 상업적으로 사용할 수 없거나 특정 사망에 대 한 비용 금지 대리는 이전 같이 d-IS에서 동일한 약물 클래스 또는 합성 화합물에서 찾을된 수 없습니다 소변 (F-페), 같은 데이터 정규화에 사용 되 14. 대표 EIEs 및 옥 시 코 돈에 대 한 외부 교정 곡선 그림 3A, B에에서 나와 있습니다. 그리고 citalopram 그림 3C, D에에서 대 한. 이 널리 처방 진통제와 항우울제, 각각, 남용 잠재력. 상대 이온 응답 비율을 일치 하는 그들의 d-는 측정 됩니다. 이 경우에, MSI-CE-MS, 5 다른 약 calibrants, 구성에서 직렬 주입 구성 중복 합성 소변 빈 함께 단일 실행 내에서 분석 된다. 전반적으로, 좋은 선형성 (R2 > 0.990) 20-fold 농도 이상의 범위 패널 내에 84-마약 DoA와 (즉, 양이온 alkaloids) 그들의 대사 산물의 대부분의 검색에 대 한 적절 한 감도와 달성 했다 14. 모든 경우에, 약물 metabolites 감지 됩니다 그들의 심사 마감 위에 그들의 protonated 분자 이온 [MH+] 제한 (> 50 ng/mL), 특정 산 성/중성 약에서 가난한 이온화 효율을 제외 하 고는 (예를 들면, 마리화나-COOH), 바비 (예, secobarbital), cannabinoids 및 면제가 (예를 들어, 캐 러) 등 긍정적인 이온 모드.
그림 3: 일련의 대표 DoA의 정량화에 대 한 추출된 이온 electropherograms (EIE). 그들의 상대 이온 응답 비율에 따라 외부 교정 곡선을 생성 하 여 이렇게 한 일치 d-20-fold 선형 동적 범위입니다. (A)의 옥 시 코 돈-d3 및 빈 옥 시 코 돈 calibrants의 5-포인트 보정 곡선의 주입을 중복. 옥 시 코 돈, 파생 (슬로프) 및 선형성 (R2), 선형 회귀 ±1σ를 나타내는 오차 막대와 다음에 대 한 (B) 외부 보정 곡선 (n = 4). (C) 주입의 citalopram d6 및 빈 citalopram calibrants 5-포인트 보정 곡선의 중복. (D) 외부 교정 곡선 citalopram, 감도 (슬로프) 및 선형성 (R2), 파생 선형 회귀 오류와 함께 다음과 같은 바 대표 ± 1 SD (n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
기존의 크로마 분판은 일반적으로 복잡 한 약 혼합물 및 열 가공을 해결 하기 위한 그라데이션 차입 뒤 다음 실행 당 단일 샘플 주입에 의존 합니다. 이러한 요구 사항을 근본적으로 제한 샘플 처리량 및 듀티 사이클 최적의 열 전환 프로그램을 사용 하는 경우에. 이러한 맥락에서 직장, 독성, 또는 GC-MS/MS와 LC-MS/MS 점점, 치료 모니터링 응용 프로그램에 대 한 높은 볼륨 소변 약물 분석은 이렇게 병렬로 수행 하지만 두 번째 계층으로 우선적으로 사용 또는 확정 때 테스트 (즉, 법적 또는 의료 컨텍스트) 필요. 이것은 데이터 분석 합병증 뿐 아니라 훨씬 더 높은 자본 투자 및 운영 비용, 공인된 실험실 내에서 여러 수단이 플랫폼 분석 샘플을 비교 했을 때. 결과적으로 immunoassays는 여전히 경향이 가양성 및 false 네거티브 많은 마약 클래스 중 신흥 디자이너 약물에 대 한 항 체 시 약에 제한 된 액세스로 임에도 불구 하 고 일상적인 마약 검사에 대 한 기본 방법 남아 있다. 이전 연구는 MSI-CE-MS에 따라 멀티플렉스 분판 한 크기 순서까지 샘플 처리량을 향상 시키기 위해 간단한 솔루션을 제공을 증명 하고있다. 또한,이 방법은 높은 데이터 충실도 효과적인 일괄 수정 및 품질 관리12,,1314의 구현에 따라 바이오 마커 발견에 대 한 새로운 데이터 워크플로 디자인에 대 한 수 있습니다. 그러나, 10 또는 더 연속 유체역학 주사 MSI-CE-MS에 도입 효율 분판, DoA에 그들의 대사 산물을 분석 하는 경우 선택도 손상 될 수 있는 유지 하는 데 필요한 효과적인 모 세관 길이 단축 인간의 소변
분리를 사용할 때 중요 한 약물 분포/이 성체의 해상도 향상 전체 모 세관 길이 (120 cm), 활용 되도록 각 유체역학 샘플 주입 다음 BGE의 electrokinetic 주사 여기, 도입 전체 검색 TOF-MS (그림 1A)에 의해 데이터 수집 합니다. 최근 보고서14의 경우에 비해 더 나은 해상도 큰 마약 패널 심사 때이 매우 중요 몇 가지 중요 한 isobaric/이성질체 DoA와 그들의 대사 산물에 대 한 달성 된다. 예를 들어, 몇 가지 중요 한 구조/기능 그룹이 성체의 해상도 실현 되었다, 3 개의 유사한 opioid 약물/대사 산물 (그림 1B), 두 메 담 페타 민, 2 개의 비관련된 opioid 분포 (그림 1C), 등 위치이 성체 (그림 1D) 모든 경우에 동일한 실행 내에서 서로 다른 calibrant 솔루션의 직렬 주입에서 샘플 이성 부정적인 소변 제어/빈에 의해 확인으로 중요 하지 않습니다. 또한, 향상 된 해상도 또한 특정 d-ISs cotinine d3 및 3, 4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP d3 등 imipramine, 패널 isobaric 약물과 관련 된 여러 간 간섭에 대 한 실현은 norfentanyl d5 및 케 타 민, 코데인-d6 및 설트랄린, 코카인-d3 그리고 졸 피 뎀. 이 결과 주요 배경 요도 방해 뿐만 아니라 다른 isobaric 방해 패널 내에서 약물이 연구 (예를 들어, noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylphenidate), 더 나은 해결 확장 (예: , 소스 조각 암페타민과 크의 이온)14. 실제로, 특정 DoA의 putative 식별을 위해 두 개의 직교 매개 변수에 대 한 액세스가 거짓인 isobaric 간섭, 즉 정확한 인해 대량 d-ISs와 comigration와 결합을 줄이기 위한 중요 합니다. 또한, 하나 이상의 biotransformed 대사 산물 부모 약 hydroxylated, demethylated, 또는 그대로 glucuronide 마약 등 동일한 샘플 내에서 검색 conjugate(s), 창 확대 하면서 마약 식별으로 자신감을 더 추가 대 한 검색.
소변 약물 검사에 대 한 권장된 마감 레벨에서 지침에 따라 방법을 바이어스를 줄이기 위해 그들의 약 동학, 독성, 그리고 배경 간섭에 따라 (1000 ng/mL에서 50까지) DoA의 다른 클래스에 대 한 광범위 하 게 다 약물 남용 및 정신 건강 서비스 행정 (SAMHSA)14. MSI-CE-MS를 감지 하 여 최소한의 샘플 전처리와 소변에 직접 DoA의 다양 한 클래스를 식별에 대 한 잠재적인 알려진된 처방 기록 임상 우울증된 환자 그룹에 적용 되었습니다. 메타 돈 (처방), 암페타민 (nonprescribed/불법), 벤라팍신 (처방), 희석, 아직 nonhydrolyzed, 소변 샘플에 (처방) pregabalin의 확실 한 식별 MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 시연 했다. 이 권장에서 첫 번째 샘플 위치에 84-약물 혼합 한 특정 주입 위치에서 검색 된 약물의 직접적인 비교에 근거 했다 심사는 내부 참조/QC 및 긍정적인 통제로 인하 수준 (그림 2)입니다. 또한, 절대 마약 정량화 때 가능한의 d 기준으로 약물에 대 한 측정 이온 응답 비율에 따라 외부 보정 곡선 (그림 3)를 사용 하 여-이다. 가장 컬럼에 분판, 달리는 마이그레이션 시간 차이 d에 영향을 미치는 중수소 효과가 없습니다-은 및 그것의 nondeuterated 약물 때문에 유사한 전기 이동 mobilities ce에서 무료 솔루션 보유. 실제로, DoA의 마이그레이션 동작 정확 하 게 ce, 즉 분자 볼륨 및 효과적인 충전 (pK는는)14그들의 기본적인 물리 화학적 속성/화학 구조에 따라 모델링 됩니다. 때문에 많은 약물도 심사 마감 레벨 조정으로 그들의 측정된 농도 보다 낮은 예상에 비해 필요 (예를 들어, 모 르 핀 glucuronide), 소변에서 배설 하기 전에 중요 한 이차 대사를 받 다 총 약물 검출을 위한 효소 가수분해를 활용 하는 방법. "희석-와-쏴" 소변 약물 테스트, 비용/시간, 샘플 처리, 그리고 잠재적인 편견 또는 일괄 유사 때문에 불완전 한 효소 가수분해를 줄이는 외의 주요 혜택은 그 추정 화면-긍정적인 경우 추가 확인은 동일한 샘플 내에서 하나 이상의 관련된 약물 metabolites의 탐지. 이것 또한 제공 한다 마약에 대 한 깊은 통찰력 개별 환자에 대 한 약 동학 및 최적 복용량 요구를 "빠른" metabolizers 또는 짧은 반감기와 처방/불법 마약에 대 한 검색을 개선 하는 동안. 또한, comigration는 일치와 d-MSI-CE-MS를 사용 하 여 때 상영 하는 신뢰할 수 있는 약물에 대 한 재생 두 가지 중요 한 기능입니다-즉, 이온의 차이 또한 수정 하는 동안 (즉, 환자 #) 정확한 샘플 주입 위치 식별 향상 된 정밀도 정확도 대 한 응답/주입 양.
미래 작동 다중화 분판 HRMS 대량 소변 마약 QC/QA 테스트에 필요한 결합의 자동화 된 데이터 처리를 촉진 하기 위하여 사용자 지정 된 소프트웨어 도구를 개발 하는 것을 목표로 합니다. DoA의 넓 스펙트럼 심사에 대 한 MSI-CE-MS의 엄격한 유효성 검사는 또한 조사 위험이 높은 환자의 큰 동료 중 처방된 약 준수 및 잠재적인 오용/대체 손상 시킬 수 있는 객관적으로 평가 하기 위해 치료 효능, 환자 안전, 및 정신 평가/진단 또한 천연/합성 cannabinoids의 포괄적인 검사에 대 한 부정적인 이온 모드 감지 필요에 따라 알칼리 성 조건 하에서 산 성/음이온의 클래스 DoA와 그들의 대사 산물의 상호 보완적인 분석 MSI-CE-MS에 의해 수행 됩니다. 이것은 중요 한 캐나다와 미국의 여러 레크리에이션 마리화나의 합법화의 어렴 풋 한 공중 위생 의미를 주어진입니다. TOF-MS에 의해 전체 스캔 데이터 수집의 중요 한 이점은 이다 소변 표본은 더 이상 후속 테스트에 사용할 수 있는 반면 다른 생활 또는 식이 노출 더 잘 평가 될 수 있다 경우에 샘플의 회고전 분석 수행할 수 없습니다. 약물 치료에 대 한 차동 응답 이해. 요약 하자면, MSI-CE-MS에 의해 급속 한 아직 정확한 약물 감시 방법 방법을 제공 합니다 직접 주입/주변 뿐만 아니라 기존의 타겟된 immunoassays 상당한 이점을 이온화-MS/MS 확인할 때 방해/바이어스 하는 경향이 있는 DoA와 증분 비용에서 복잡 한 생물 학적 샘플에서 그들의 대사 산물의 확장 된 패널.
Disclosures
저자는 멀티플렉스 상영으로 MSI CE MS에 미국 특허 (PCT/CA2014/050454)를 공개 화학 분석을 위한 플랫폼 및 데이터 워크플로.
Acknowledgments
P.B.M. 혁신, 게놈 캐나다 맥 매스 터 대학에서 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다, 캐나다 재단 지원 자금 인정을 바란다. 저자 그들의 통찰력이 토론 Seroclinix 공사에서 하 워드 리와 애질런트 기술에서 마커 스 김 박사 감사. 또한, 저자가이 연구에 사용 된 deidentified 환자 소변 샘플에 정신과의 부 및 맥 매스 터 대학에서 행동 과학 및 액세스에 대 한 세인트 조셉의 병원 기분 장애 클리닉에서 박사 자 Samaan 인정 .
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
7100 Capillary Electrophoresis System | Agilent Technologies Inc. | G7100A | CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation |
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer | Agilent Technologies Inc. | G6230B | HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation |
CE-ESI-MS Sprayer Kit | Agilent Technologies Inc. | G1603A | CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette |
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser | Agilent Technologies Inc. | G1310B | Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant |
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | -- | Software used for control of CE-MS system |
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01) | Agilent Technologies Inc. | -- | Software used for processing of CE-MS data |
Shortix Capillary Cutter | Agilent Technologies Inc. | 5813-4620 | Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries |
Capillary Window Maker | Microsolv Inc. | 07200-S | Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary |
Flexible Fused-silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies Inc. | TSP05375 | Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD) |
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE) | Cerilliant Inc. | Miscellaneous | Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine) |
References
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철회 문제 146 약물 검사 약물 감시 마약 남용 약물 대사 소변 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 임상 우울증 만성 통증의 높은 처리량 검열Erratum
Formal Correction: Erratum: High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 05/16/2019.
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