Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca2 + signalering i Situ

Summary

Genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan i situ Ca^{2 +} imaging utføres. For å maksimere data utvinning fra slike innspillinger, kreves det riktige analyse av Ca^{2 +} signaler. Protokollene i denne utredningen lette kvantifisering av Ca^{2 +} signaler registrert i situ spatiotemporal kartlegging og partikkel-baserte analyser.

Abstract

Ca^{2 +} imaging isolert celleområde eller bestemte typer celler i intakt vev ofte avslører komplekse mønstre av Ca^{2 +} signalering. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om den underliggende hendelser som mulig. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca^{2 +} signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplitude kan gi noen biologiske informasjon kreves for intracellulær signalisere. Høyoppløselig Ca^{2 +} imaging vanligvis resulterer i kjøp av store datafiler som er tidkrevende prosessen i forhold til oversette tenkelig informasjonen i kvantifiserbare data, og denne prosessen kan være utsatt for menneskelig feil og bias. Analyse av Ca^{2 +} signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger for tilfeldig utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Denne metoden ignorerer mye viktig signalnettverk informasjonen i FOV. Derfor, for å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak med Ca^{2 +}fargestoffer eller optogenetic Ca^{2 +} tenkelig, passende romlige og tidsmessige analyse av Ca^{2 +} signaler er nødvendig. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen vil beskrive hvordan en stor mengde data kan hentes fra Ca^{2 +} tenkelig opptak til rette mer fullstendig analyse og måling av Ca^{2 +} signaler innspilt fra celler ved hjelp av en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca^{2 +} signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca^{2 +} signalering i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC), ved hjelp av GECIs.

Introduction

Ca^{2 +} er en allestedsnærværende intracellulær budbringer som styrer en rekke cellulære prosesser, for eksempel muskel sammentrekning^1,2, stoffskifte³, celle spredning^{3,4, 5}, stimulering av nevrotransmitter utgivelsen på nerve terminaler^6,7, og aktivering av transkripsjon faktorer i kjernen. ⁷ intracellulær Ca^{2 +} signaler ofte tar form av forbigående høyder i cytosolic Ca^{2 +}, og dette kan være spontan eller oppstå Agonistiske stimulering avhengig av den celle type⁸. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca^{2 +} signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplituden kan gi biologiske informasjon kreves for intracellulær signal^{5, 7 , 9}. cytoplasmatiske Ca^{2 +} signaler kan resultere av Ca^{2 +} fra ekstracellulære plass eller via Ca^{2 +} utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER) via Ca^{2 +} utgivelsen kanaler som ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat reseptorer (IP₃Rs)¹⁰. RyRs og IP₃Rs kan både bidra til generasjon av Ca^{2 +} signaler og felles åpningen av disse kanalene, som kombinert med ulike Ca^{2 +} tilstrømningen mekanismer kan resultere i en myriade av Ca^{2 +} signalisere mønstre som er formet av tallene og åpne sannsynligheten av Ca^{2 +} tilstrømningen kanaler, profilen for expression av Ca^{2 +} utgivelsen kanaler, nærhet mellom Ca^{2 +} tilstrømningen og utgivelsen kanaler, og uttrykket og distribusjon av Ca^{2 +} reopptak og ekstrudering proteiner. Ca^{2 +} signaler kan ta form av uniform, langvarig, høy intensitet globale svingninger som kan vare i flere sekunder eller minutter, spre intracellulær og intercellulære Ca^{2 +} bølger som kan krysse intracellulær avstander over 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}eller flere kort, romlig lokalisert hendelser som Ca^{2 +} gnister og Ca^{2 +} puffs som oppstår på titalls millisekund tidsrammer og spre mindre enn 5 µm^17,18,19,20.

Fluorescerende mikroskopi er blitt anvendt vidt å overvåke Ca^{2 +} signalisere isolert og kultivert celler og intakt vev. Tradisjonelt disse eksperimentene omfattet bruk av fluorescerende Ca^{2 +} indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric fargestoffer som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blant annet ^21,22,23. Disse indikatorene ble utformet permeable til celle membraner og deretter bli fanget i celler i spalting av en ester gruppe via endogene esterases. Binding av Ca^{2 +} til høy affinitet indikatorer forårsaket endringer i fluorescens når celler og vev ble opplyst av aktuelle bølgelengder av lys. Bruk av cellen permeable Ca^{2 +} indikatorer forbedret kraftig vår forståelse av Ca^{2 +} signalering i levende celler og tillatt romlig oppløsning og måling av disse signalene som ikke var mulig ved assaying Ca^{2 +} signaler på andre måter, for eksempel elektrofysiologi. Tradisjonelle Ca^{2 +} indikatorer har imidlertid flere begrensninger, som photobleaching som skjer over utvidet opptak perioder²⁴. Mens nyere Ca^{2 +} indikator fargestoffer som Cal520/590 har kraftig forbedret signal til støy forhold og muligheten til å oppdage lokale Ca^{2 +} signaler²⁵, kan problemer med photobleaching fortsatt et problem for noen etterforskere ^26,27,28. Stupbratte photobleaching begrenser også forstørrelsen, antall bildeopptak, og oppløsning som kan brukes for opptak, som økt objektive makt og høyere priser på bildeopptak krever økt eksitasjon lysintensiteten som øker photobleaching.

Disse begrensningene av tradisjonelle Ca^{2 +} indikator fargestoffer er forverret ved registrering av Ca^{2 +} signaler på stedet, for eksempel når innspillingen intracellulær Ca^{2 +} signaler fra intakt vev. På grunn av problemene ovenfor, visualisering av Ca^{2 +} signaler i situ med cellen permeable Ca^{2 +} indikatorer har vært begrenset til strømsparingsmodus forstørrelse og reduserte priser for bildebehandling, begrenser evnen til etterforskerne å registrere og kvantifisere timelig eller romlig begrenset subcellular Ca^{2 +} signaler. Derfor har det vært vanskelig å fange, analysere og verdsette romlige og tidsmessige kompleksiteten av Ca^{2 +} signaler, som kan være viktig for generering av biologiske responser er ønsket, som beskrevet ovenfor. Analyse av Ca^{2 +} signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger fra utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Tilfeldig valg av antall, størrelse og plassering av ROIs, avhengig av innfall av forskeren, kan alvorlig bias resultatene. Og iboende skjevheter med avkastningsanalyse, ignorerer denne tilnærmingen mye av viktig signalnettverk informasjonen i FOV, som dynamisk Ca^{2 +} hendelser i opptil Avkastningen er valgt for analyse. Videre unnlater analyse av ROIs å gi informasjon om romlige karakteristikkene av Ca^{2 +} signalene observert. For eksempel kan det ikke være mulig for å skille mellom en økning i Ca^{2 +} som følge av en overføring av Ca^{2 +} bølge og en sterkt lokalisert Ca^{2 +} release event fra tabeller av Ca^{2 +} signaler i en avkastning.

Ankomsten av genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan Ca^{2 +} bildebehandling kan være utført i situ^{29,30,31,32,33} . Det er flere fordeler med å bruke GECIs over fargestoffer. Den viktigste kanskje er at uttrykk for GECI kan utføres på en celle bestemt måte, noe som reduserer uønsket bakgrunn forurensning fra cellene ikke av interesse. En annen fordel med GECIs over tradisjonelle Ca^{2 +} indikatorer er at photobleaching reduseres (som fluorescens og consequentially photobleaching oppstår bare når celler er aktive), sammenlignet med fargestoff lastet prøver, spesielt på høy forstørrelse og høye image fange³⁴. Dermed tenkelig med GECIs, som en GCaMP rekke optogenetic sensorer, gir etterforskerne evnen å fortegnelse korte, lokalisert sub mobilnettet Ca^{2 +} signaler i situ og undersøke Ca^{2 +} signalering i celler i deres innfødte miljøer som ikke er mulig tidligere. For å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak, kreves det riktige romlige og tidsmessige analyse av Ca^{2 +} signaler. Det bør bemerkes at mens GECIs kan tilby noen klare fordeler, studier har nylig avdekket at Ca^{2 +} bildebehandling kan utføres vellykket fra store populasjoner av ulike nevrokjemiske klasser av neurons samtidig ved hjelp av konvensjonelle Ca^{2 +} indikatorer som ikke er genetisk kodet inn i dyr³⁵. Denne tilnærmingen brukes post hoc immunohistochemistry for å avsløre flere forskjellige klasser av neurons skyting på høy frekvens i synkroniserte støt, og unngikk potensialet som genetiske modifikasjoner til dyret kan ha forstyrret den fysiologiske virkemåten etterforskeren søker å forstå^35,36.

Protokollene i notatet rette mer fullstendig analyse og kvantifisering av Ca^{2 +} signaler innspilt fra celler i situ med en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca^{2 +} signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca^{2 +} signalisere i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC). ICC er spesialiserte celler i fordøyelsessystemet (GI) som viser dynamisk intracellulær Ca^{2 +} signalnettverk, som visualisert ved hjelp av mus uttrykke GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. Ca^{2 +} transienter i ICC er knyttet til aktivering av Ca^{2 +}-aktivert Cl^– kanaler (kodet av Ano1) som er viktige i å regulere excitability av intestinal glatt muskel celler (SMCs)^{43, 44,45}. Dermed er studiet av Ca^{2 +} signalering i ICC grunnleggende for å forstå intestinal motilitet. Murine tynntarmen tilbyr et utmerket eksempel for denne demonstrasjonen, som det er to klasser av ICC som skilles anatomisk og kan visualiseres uavhengig: jeg) ICC ligger i området mellom den sirkulære og langsgående glatt muskelen lag, rundt myenteric plexus (ICC-min). Disse cellene som Pacemakerceller og generere den elektriske aktiviteten kjent som langsom bølger^46,47,48,49; II) ICC ligger også blant en plexus rike i terminalene på motor neurons (dyp muskel plexus, dermed ICC-DMP). Disse cellene tjene som meglere svar til enteric motor neurotransmission^37,39,40,50. ICC-min ICC-DMP morphologically distinkte og er Ca^{2 +} signalnettverk virkemåtene som er vesentlig for å utføre sine oppgaver. ICC-min er stellate i form og danner et nettverk av sammenhengende celler via gapet veikryss^51,52. Ca^{2 +} signaler i ICC-min manifest som kort og romlig lokalisert Ca^{2 +} utgivelsen hendelser på flere områder asynkront gjennom ICC-min nettverket som visualisert innenfor en FOV (fotografert med en 60 X-målet)³⁸. Disse asynkrone signalene er timelig organisert i 1 sekund klynger som, når ordnet sammen, utgjør en netto 1 s mobilnettet økning i Ca^{2 +}. Disse signalene overføres celle til celle i ICC nettverket og derfor organisere Ca^{2 +} signalering, generert fra sub mobilnettet steder, i en vev bredt Ca^{2 +} bølge. Timelige klynger og summering av Ca^{2 +} signaler i ICC-min har blitt kalt Ca^{2 +} forbigående klynger (CTCs)³⁸. CTCs oppstå rytmisk (f.eks ganske like varigheter og lignende periodene mellom CTCs) 30 ganger per minutt i musen. Derimot ICC-DMP spindel formet celler, noen med sekundære prosesser, som distribuerer mellom SMCs og varicose nerve prosesser og ikke uavhengig danner et nettverk^51,52. ICC-DMP skjemaet gapet veikryss SMCs, men og funksjon i denne større syncytium, kalles SIP syncytium⁵³. Ca^{2 +} signaler oppstår på flere områder langs lengden på cellene, men disse transienter ikke entrained eller timelig gruppert, som observert i ICC-min³⁷. Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP forekommer i en Stokastisk måte, med varierende intensitet, varighet og romlig egenskaper. Protokollene nedenfor, bruker eksemplet med Ca^{2 +} signalering i ICC-min og ICC-DMP, beskriver teknikker for å analysere komplekse signalering i bestemte typer celler i situ. Vi utnyttet induserbart grobunn-Lox p systemet for å uttrykke GCaMP6f i ICC, etter inducing aktivering av grobunn-Recombinase (grobunn) drevet av en ICC bestemt arrangøren (Kit).

Protocol

Alle dyr som brukes og protokollene i denne studien var i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle dyr bruk og omsorg komiteen på University of Nevada, Reno. 1. generasjon KitGCaMP6f mus Krysse Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) og c-Kit/ grobunn-ERT2 (Kit-grobunn mus) til å generere ICC bestemte GCaMP6f uttrykke dyr (Kit-Cre-GCaMP6f mus).Merk: GCaMP6f ble brukt på …

Representative Results

Bruke Kit-Cre-GCaMP6F mus (figur 1), dynamiske Ca2 + signalering atferd av ICC i fordøyelsessystemet kan avbildes i situ. Med AC confocal mikroskopi, kan høyoppløselige bilder av spesifikke populasjoner av ICC skaffes uten forurensende signaler fra andre populasjoner av ICC i samme vev men i anatomisk forskjellige nivåer av fokus (figur 2A)37 , 39 ,</s…

Discussion

Ca^{2 +} avbilding av bestemte typer celler i intakt vev eller innen nettverk av celler ofte avslører komplekse mønstre av Ca^{2 +} transienter. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om underliggende hendelser og kinetics av disse hendelsene som mulig. STM og PTCL analyse gir mulighet for å maksimere mengden av kvantitative data gitt opptak av denne typen.

Smalt, spindel-formet morfologi av ICC-DMP gjør dem…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6