JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Längsgående morfologiska och fysiologiska övervakning av tredimensionella tumör Spheroids använder optisk koherenstomografi

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Optisk koherenstomografi (OCT), en tredimensionell bildteknik, användes till att övervaka och karaktärisera tillväxt kineticsen av flercelliga tumör spheroids. Exakt volymetriska kvantifiering av tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri död vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning däremot påvisades.

Abstract

Tumör spheroids har utvecklats som en tredimensionell (3D) cell kultur modell av cancer forskning och anti-cancer läkemedelsutveckling. Dock hög genomströmning imaging modaliteter utnyttja ljusa fält eller fluorescens upptäckt, för närvarande inte kan lösa övergripande 3D-strukturen för den tumör sfäroid på grund av begränsad ljuspenetrering, diffusion av fluorescerande färgämnen och djup-potentiellt. Vårt labb visade nyligen, användning av optisk koherenstomografi (OCT), en etikett-fri och icke-förstörande 3D imaging modalitet, för att utföra längsgående karakterisering av flercelliga tumör spheroids i en plattan med 96 brunnar. OCT kunde få 3D morfologiska och fysiologiska information för tumör spheroids växer upp till ca 600 µm i höjd. I denna artikel visar vi en hög genomströmning okt (HT-okt) bildsystem som genomsöker hela flera väl plattan och erhåller 3D OCT-data av tumör spheroids automatiskt. Vi beskriva detaljerna i HT-okt system och konstruktion riktlinjerna i protokollet. Från den 3D OCT-data, en kan visualisera den övergripande strukturen på sfäroid med 3D-renderade och ortogonala skivor, karakterisera längsgående tillväxtkurvan den tumör sfäroid baserat på morfologiska information om storlek och volym och övervaka tillväxten av de döda-cell regionerna i den tumör sfäroid baserat på optisk inneboende dämpning kontrast. Vi visar att HT-ULT kan användas som en hög genomströmning bildgivande modalitet för drug screening samt karaktärisera biofabricated prover.

Introduction

Cancer är den näst vanligaste orsaken till dödsfall i världen1. Utveckla läkemedel inriktning cancer är av avgörande betydelse för patienter. Dock är det beräknat att mer än 90% av nya anti-cancer läkemedel misslyckas i utvecklingsfasen brist på effekt och oväntad toxicitet i kliniska prövningar2. En del av orsaken kan hänföras till användningen av enkel tvådimensionell (2D) cell kultur modeller för sammansatta screening, som ger resultat med begränsade prediktiva värden av sammansatta effekt och toxicitet för de följande stadierna av drug discovery2 , 3 , 4. nyligen, tredimensionella (3D) tumör sfäroid modeller har utvecklats för att ge kliniskt relevanta fysiologiska och farmakologiska data för anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Eftersom dessa spheroids kan härma vävnad-specifika egenskaper för tumörer i vivo, såsom näringsämnen och syre kan gradient, hypoxisk kärna samt drog resistens19, användningen av dessa modeller potentiellt förkorta drug discovery tidslinjer, minska kostnaderna för investeringar och få nya läkemedel till patienter mer effektivt. Ett kritiskt förhållningssätt till utvärdera sammansatta effekt i 3D tumörutveckling sfäroid är att övervaka sfäroid tillväxt och återkommande under behandlingar9,26. Gör detta genom är kvantitativa karakteriseringar av tumör morfologi, som inbegriper dess diameter och volym, med högupplösta avbildningsmetoder, absolut nödvändigt.

Konventionella avbildningsmetoder, såsom ljusa fält, fas kontrast7,9,22,24och fluorescence mikroskopi8,9,16, 18,22 kan ge ett mått på den sfäroid diameter men inte kan lösa den övergripande strukturen på sfäroid i 3D-rymden. Många faktorer bidrar till dessa begränsningar, inklusive penetration av sondering ljuset i sfäroid; diffusion av fluorescerande färgerna i sfäroid; avger fluorescerande signaler från glada fluorescerande färgämnen inuti eller på den motsatta ytan sfäroid på grund av stark absorption och spridning; och djup-avveckling av dessa imaging modaliteter. Detta leder ofta till en felaktig volymmätning. Utvecklingen av nekrotisk kärnan i spheroids härmar nekros i i vivo tumörer6,10,15,19,25. Patologiska funktionen är osannolikt reproduceras i 2D cell kulturer19,25,27,28. Med en sfäroid storlek större än 500 µm i diameter, en trelagers koncentriska struktur, kan inklusive ett yttre lager av prolifererande celler, ett mellanlager av quiescent celler och en nekrotisk kärna, observeras i sfäroid6,10 ,15,19,25, på grund av brist på syre och näringsämnen. Levande och döda cellen fluorescens bildbehandling är standardmetoden att märka gränsen av nekrotisk kärnan. Dock igen, hindra genomföringar av både dessa fluorescerande färger och synligt ljus potential att sond i nekrotisk kärnan att övervaka dess utveckling i sin riktiga form.

En alternativ 3D imaging modalitet, införs optisk koherenstomografi (OCT) för att karakterisera de tumör spheroids. OCT är en biomedicinsk imaging teknik som kan förvärva etikett-fri, icke-förstörande 3D data från upp till 1-2 mm djup i biologiska vävnader29,30,31,32,33 ,34. OCT sysselsätter låg-coherence interferometri att upptäcka bakåtspritt signaler från olika djup av provet och ger rekonstruerade djup-löst bilder på micron-nivå rumsliga upplösningar i både laterala och vertikala riktningar. OCT har allmänt antagits i oftalmologi35,36,37 och angiografi38,39. Tidigare studier har använt OCT att iaktta morfologi av in vitro- tumör spheroids i basalmembranet matris (t.ex., Matrigel) och utvärdera sina svar till fotodynamisk terapi40,41. Nyligen har föreligga vår grupp en hög genomströmning OCT imaging plattform för att systematiskt övervaka och kvantifiera tillväxten kineticsen av 3D tumör spheroids i plattor med flera42. Exakt volymetriska kvantifiering av 3D tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri nekrotisk vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning kontrast visades. Detta dokument beskriver detaljerna i hur OCT imaging plattformen uppfördes och anställda att få högupplösta 3D-bilder av tumör spheroids. De stegvisa kvantitativa analyserna av tillväxt kineticsen av 3D tumör spheroids, inklusive noggranna mätningar av sfäroid diameter och volymer, beskrivs. Dessutom presenteras metoden för icke-destruktiv detektering av nekrotisk vävnad regioner använder ULT, baserat på inneboende optisk dämpning kontrasten.

Protocol

1. beredning av celler Få cellinjer från en kvalificerad leverantör.Obs: Kontrollera att celler från cell linjer av intresse kan bilda sfäroid i kultur media eller med hjälp av ett substrat (basalmembranet matrix som Matrigel). Titta in i den litteratur9 eller utföra en runda av inför experiment för en kontroll. Tina de frysta celler efter det specifika förfarandet cellinje leverantören tillhandahållit. Ett allmänt förfarande kan hittas någon annanstans<sup c…

Representative Results

Hög genomströmning optisk koherens tomografi avbildning av Spheroids i en plattan med 96 brunnar Figur 3 uppvisar resultatet av HT-okt skanning av en plattan med 96 brunnar med HCT 116 tumör spheroids på dag 3. Sekventiell genomsökning av hela plattan börjar från nedre högra brunnen (H12). Figur 3B visar flödet kartlägger av programvara genomförandet av HT-okt s…

Discussion

Tumöraktivitet är mycket relevanta för dess morfologiska struktur. Liknar övervakning karakteristiska tillväxtkurvan för 2D cellkulturer, spåra tillväxtkurvan för 3D tumör spheroids är också en konventionell metod att karakterisera den långsiktiga sfäroid tillväxt beteenden för olika cellinjer. Bland annat kan vi karakterisera den narkotika Svaren genom att analysera tumör försämring eller tumör återväxt direkt återspeglas i tillväxtkurvan. Kvantitativ bedömning av 3D tumör spheroids, inklusive …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av NSF beviljar IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH grants R21EY026380, R15EB019704 och R01EB025209 och Lehigh University startup fonden.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  2. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  3. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  4. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  5. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  6. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  7. Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  8. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  9. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  10. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  11. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  12. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  13. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  14. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  15. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
  16. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  17. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  18. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  19. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  20. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  21. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
  22. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  23. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  24. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  26. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  27. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  28. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  29. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
  30. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
  31. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  32. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  33. Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
  34. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
  35. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  36. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  37. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  38. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
  39. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  40. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  41. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  42. Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
  43. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
  44. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  45. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
  46. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  47. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  48. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  49. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  50. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  51. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Tags

3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
check_url/59020?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image