Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA
Summary
Er zijn gedetailleerde protocollen voor beide in vitro en in cel selectieve 2′-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) experimenten om de secundaire structuur van pre-mRNA opeenvolgingen van belang in de aanwezigheid van een kleine molecule van RNA-targeting in dit artikel wordt gepresenteerd.
Abstract
In het proces van de ontwikkeling van de drug van kleine moleculen RNA-targeting, is ophelderen van de structurele veranderingen op hun interacties met doel RNA-sequenties gewenst. Wij leveren hierin een gedetailleerde in vitro en in cel selectieve 2′-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) protocol om te bestuderen van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van een experimentele drug voor spinale musculaire atrofie (SMA), voortbestaan van motor neuron (SMN)-C2, inzonderheid exon 7 van de pre-mRNA van het gen SMN2. In in vitro vorm, is een RNA-volgorde van 140 nucleotiden met SMN2 exon 7 getranscribeerd door T7 RNA polymerase, gevouwen in aanwezigheid van SMN-C2 en vervolgens bewerkt door een milde 2′-OH acylering reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Deze 2′-OH-INR adduct is verder peilden door een 32P-geëtiketteerden primer extensie en opgelost door polyacrylamide gelelektroforese (pagina). Omgekeerd, 2′-OH acylering in in cel vorm plaatsvindt in situ met SMN-C2 gebonden cellulaire RNA in levende cellen. De volgorde van de pre-mRNA van exon 7 in het SMN2-gen, samen met SHAPE-geïnduceerde mutaties in de primer-extensie, werd vervolgens versterkt door PCR en onder voorbehoud van de volgende generatie sequencing. Vergelijken van de twee methoden, in vitro vorm is van een meer voordelige methode en vereist geen rekenkracht te visualiseren van de resultaten. De in vitro model van de SHAPE afkomstige RNA wijkt echter soms af van de secundaire structuur in een cellulaire context, waarschijnlijk als gevolg van het verlies van alle interacties met RNA-bindende proteïnen. In cel vorm hoeft niet een radioactief materiaal werkplek en levert een nauwkeuriger RNA secundaire structuur in de cellulaire context. Bovendien, in cel vorm meestal geldt voor een groter bereik van RNA-sequenties (~ 1000 nucleotiden) door gebruik te maken van volgende-generatie sequencing, in vergelijking met in vitro vorm (~ 200 nucleotiden) die gewoonlijk is gebaseerd op pagina-analyse. In het geval van exon 7 in SMN2 pre-mRNA, de vorm van in vitro en in cel afgeleid zijn RNA modellen op elkaar lijken.
Introduction
Selectieve 2′-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) is een methode voor het meten van de kinetiek van elk nucleotide in een opeenvolging van RNA van belang en het ophelderen van de secundaire structuur op single-nucleotide oplossing1. SHAPE methodologieën, zowel in in vitro voorwaarden2,3,4 (gezuiverde RNA in een gedefinieerde buffersysteem) en in levende cellen van zoogdieren5,6, hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de secundaire structuur van halflang RNA-sequenties (meestal < 1000 nucleotiden in cel vorm en < 200 nucleotiden voor in vitro vorm). Het is met name handig om structurele veranderingen in de receptor RNA bij binding met RNA-interactie klein molecuul metabolieten2,4,7,8 en te bestuderen of mechanistische acties van RNA-targeting moleculen tijdens9,10van de ontwikkeling van de drug.
RNA-targeting drugontdekking heeft onlangs aandacht in academische laboratoria en de farmaceutische industrie11,12 getrokken via verschillende benaderingen en strategieën13,14,15 ,16. Recente voorbeelden van kleine moleculen RNA-targeting voor klinisch gebruik twee structureel verschillende experimentele drugs, LMI-07017 en RG-791618,19, voor spinale musculaire atrofie (SMA), waaruit veelbelovend blijkt resultaten in fase II klinische proeven20. Beide moleculen werden aangetoond voor doel voortbestaan van motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA en reguleren de splicing proces van de SMN2 gen6,17,21. Wij eerder blijk gegeven van de toepassing van in vitro en in cel vorm in een onderzoek naar de structurele veranderingen van de target RNA in het bijzijn van een analoge van RG-7916 SMN-C26genoemd.
In principe meet vorm de 2′-OH acylering snelheid van elk nucleotide van een opeenvolging van RNA in aanwezigheid van overtollige hoeveelheden een zelf blussen acylering reagens op onpartijdige wijze. Het reagens acylering is niet stabiel in water, met een korte halfwaardetijd van (bv T1/2 = 17 s voor 1-methyl-7-nitroisatoic zwavelzuuranhydride; of 1 M 7, ~ 20 min. voor het 2-methylnicotinic zuur imidazolide, of INR)22 en ongevoeligheid voor de identiteit van de honken kwamen23. Dit resulteert in een gunstiger acylering van de 2′-OH-groepen van flexibele grondslagen, die kunnen worden omgezet in een nauwkeurige beoordeling van de dynamiek van elk nucleotide. Specifiek, is een nucleotide in een base-paar meestal minder reactief dan een ongepaard die een 2′-OH wijzigen reagens, zoals NAI en 1 M 7.
Als we kijken naar de bron van de RNA-sjabloon en waar 2′-OH acylering plaatsvindt, kan vorm over het algemeen worden onderverdeeld in in vitro en in cel vorm. In vitro vorm gebruik gezuiverde T7 Getranscribeerd RNA en mist een cellulaire context in experimentele designs. In cel vorm plaatsvinden zowel het RNA sjabloon transcriptie en 2′-OH acylering in levende cellen; de resultaten kunnen daarom het structurele model van RNA in een cellulaire context recapituleren. In cel vorm heeft voorgelegd aan zoals in vivo vorm voor de vorm in levende cellen in de literatuur24vervoerd. Aangezien dit experiment wordt niet uitgevoerd in een dier, wij dit experiment genoemd als in cel vorm voor nauwkeurigheid.
De strategieën voor de fase van de uitbreiding primer van in vitro en in cel vorm zijn ook verschillend. In de vorm van het in vitro stopt omgekeerde transcriptie op de 2′-OH acylering positie in aanwezigheid van Mg2 +. Extensie primer 32P-labelled daarom verschijnt als een band in polyacrylamide gelelektroforese (pagina), en de intensiteit van de band is evenredig aan de acylering tarief1. In cel vorm, omgekeerde transcriptie genereert willekeurige mutaties op de 2′-OH adduct positie in aanwezigheid van Mn2 +. Het vogelgriepvirus tarief van elk nucleotide kan worden onderschept door in het rangschikken van de volgende generatie van diepte en de reactiviteit van de SHAPE op single-nucleotide resolutie kan vervolgens worden berekend.
Een potentieel probleem voor in cel vorm is de lage signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, een meerderheid van de fracties 2′-OH is ongewijzigd, terwijl de ongewijzigde sequenties allermeest naar de lezen in de volgende-generatie sequencing bezetten). Onlangs, een methode om te verrijken de 2′-OH gemodificeerde RNA, bedoelde zoals in vivo klikt u op SHAPE (icSHAPE), werd ontwikkeld door de Chang laboratorium25. Deze verrijking methode kan nuttig zijn bij het bestuderen van zwakke kleine molecules zoals RNA interacties, vooral in een transcriptome bestrijkende ondervraging.
Protocol
Representative Results
Discussion
In in vitro vorm is het cruciaal voor hoge kwaliteit homogene RNA sjabloon gebruiken. Transcriptie T7, levert echter vaak heterogene sequenties36. Vooral zijn sequenties met ±1 nucleotide in de 3′-terminus met niet te verwaarlozen opbrengsten36 meestal moeilijk te worden verwijderd door polyacrylamidegel zuivering. Heterogene RNA sjabloon kan resulteren in meer dan één set van het signaal in de sequencing gel profilering van de primer extensie product, waardoor het soms …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
