Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere plasma membran, cytoplasma og mitokondrier U937 celler uten bruk av høyhastighets sentrifugering. Denne teknikken kan brukes til å rense subcellular brøker for påfølgende undersøkelse av protein lokalisering via immunoblotting.

Abstract

I denne protokollen detalj vi en metode for å få subcellular fraksjoner av U937 celler uten bruk av ultracentrifugation eller vilkårlig vaskemidler. Denne metoden bruker hypotonisk buffere, digitonin, mekaniske lyse og differensial sentrifugering isolere cytoplasma, mitokondrier og plasma membran. Prosessen kan skaleres for å imøtekomme behovene til forskere, billig og enkel. Denne metoden vil tillate forskere å bestemme protein lokalisering i celler uten spesialiserte sentrifuger og uten bruk av kommersielle kits, begge kan være uoverkommelig dyrt. Vi har brukt denne metoden til å skille cytosolic, plasma membranen og mitokondrie proteiner i menneskelig monocytt celle linjen U937.

Introduction

Pålitelig identifikasjon av protein lokalisering er ofte nødvendig når undersøke molekylær stier i eukaryote celler. Metoder for å få subcellular fraksjoner benyttes av forskere å undersøke nærmere cellulære komponenter av interesse.

Fleste av eksisterende celle fraksjoneres metoder generelt faller inn i to hovedkategorier, vaskemiddel-baserte^1,2 og ultracentrifugation-baserte^3,4,5, som kan differensiert av hastighet, presisjon og pris. Vaskemiddel basert protokollene er avhengige av bruk av buffere med økende vaskemiddel styrke til å solubilize ulike komponenter i cellen. Dette er en rask og enkel metode for prosessering prøver kan være kostnadseffektivt Hvis antallet og størrelsen på prøvene er små. Vaskemiddel-baserte kits kan kjøpes for å isolere cytoplasmatiske membran/organelle (blandet brøkdel) og kjernefysiske fraksjoner celler. Men begrense flere ulemper forbundet med disse pakkene nytteverdien til forskere. De er laget for å lett isolere en eller to komponenter i cellen, men er i stand til å isolere alle fraksjoner fra et utvalg samtidig. Bruk av rengjøringsmidler betyr at plasma membran og membran-Tilknytta organeller vil være like solubilized og derfor ikke kan skilles fra hverandre. Ekstra komplisert oppstår fra proprietære komponentene i disse pakkene som hindrer forskere i å endre betingelsene for bestemte programmer. Til slutt, de er begrenset i antall bruker og kan være uoverkommelig dyrt for større skala eksperimenter. Ikke-rengjøringsmiddel basert kits finnes for isolering av mitokondrier, men de er ikke laget for å isolere plasma membranen og prøve avkastningen er betydelig mindre enn fra tetthet sentrifugering basert isolasjon protokoller^6,7 .

Metoder som bruker ultracentrifugation for å få fraksjoner er mer tidkrevende, men ofte resultere i renere fraksjoner enn vaskemiddel-baserte kits. Å isolere plasma membraner fra celler uten første solubilizing dem (som fører til forurensning med membran organeller) krever dem til å være lysed av en ikke-rengjøringsmiddel metode etterfulgt av separasjon av cellulære komponenter via differensial sentrifugering, med plasma membranen isolasjon krever hastigheter på 100.000 × g å oppnå. I mange tilfeller etterfølges differensial sentrifugering av isopycnic tetthet gradert sentrifugering for ytterligere separasjon av mobilnettet brøker eller fjerning av miljøgifter. Mens disse metodene er grundig og modifiserbare, inkludere ulemper kostnader, tidsforbruk og behovet for en ultracentrifuge for separasjon av brøker og ytterligere rensing via tetthet gradert sentrifugering. De fleste høyhastighets sentrifuger er en kostnad som er uoverkommelige for individuelle etterforskere og er ofte delt, core utstyr på akademiske institusjoner. Dermed blir ultracentrifuge tilgjengelighet uoverkommelige i disse situasjonene.

Denne fraksjoneres protokollen viser vi isolering av subcellular brøk uten bruk av solubilizing vaskemidler og uten høyhastighets sentrifugering. Denne metoden vil tillate forskere isolere plasma membran, mitokondrier og cytoplasmatiske komponentene i en eukaryot celle med minimal forurensning mellom fraksjoner.

Protocol

1. klargjør buffere og reagenser Merk: Se tabell 1. Utarbeide løsninger av buffer A, lyseringsbuffer B, prøve buffer og digitonin. Utarbeide buffer en ved å legge 8.77 g NaCl og 50 mL av HEPES (1 M, pH 7.4) til 900 mL vaskebuffer vann, justere siste volum til 1 L med deionisert vann.Merk: Siste konsentrasjoner er 150 mM NaCl og 50 mM HEPES. Forberede lyseringsbuffer B ved å legge til 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4) 0,75 g KCl, 0,19 g av MgCl<sub…

Representative Results

Vellykket fraksjoneres av udifferensierte U9378 celler dyrket i suspensjon ble gjort ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor og illustrert i figur 1. Prøvene med denne metoden ble utsatt for vestlige blotting9 utnytte en våt overføringsmetode å en polyvinylidene fluor (PVDF) membran. Membranen deretter undersøkt med antistoffer mot cytoplasmatiske, mitokondrie og membran lokalisert protein markører (<st…

Discussion

Utviklingen av denne protokollen oppsto fra manglende evne til å skille mitokondrie og membran datautvalg, bruke kommersielt tilgjengelige kits, for analyse av protein lokalisering under necroptosis¹⁴. Primære begrensningene av forhåndslagde kits er deres manglende evne å tilpasses behovene til forskere, kostnadene per eksempler og begrenset antall prøver kunne behandles. Metoden som presenteres her kan utføres uten bruk av dyre reagenser og uten behovet for dyrt utstyr. Denne metoden kan sk…

Materials

Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000