Cette étude décrit un haut débit, essai micro-neutralisation d’imagerie afin de déterminer le titre des anticorps neutralisants spécifiques pour le virus respiratoire syncytial (VRS). Ce format de test a été testé sur les types d’échantillons différents.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Un test de Micro-neutralisation du Virus respiratoire Syncytial (VRS) amélioré et haut débit
Dans cet article
Résumé
Résumé
Respiratoires syncytiales virus spécifique des anticorps neutralisants (RSV NAbs) sont un marqueur important de protection contre la RSV. Un certain nombre de formats différents test est actuellement utilisées dans le monde y a donc un besoin d’une méthode précise et haut-débit pour mesurer la RSV NAbs. Nous décrivons ici une analyse micro-neutralisation axée sur l’imagerie qui a été testée sur le sous-groupe RSV A et peut également être adaptée pour la RSV sous-groupe B et types d’échantillons différents. Cette méthode est très reproductible, avec des variations entre dosages pour l’antisérum de référence est inférieur à 10 %. Nous croyons que ce dosage peut être facilement établi dans de nombreux laboratoires dans le monde entier à un coût relativement faible. Développement d’un test amélioré et à haut débit qui mesure RSV NAbs représente une avancée significative pour la normalisation de cette méthode au niveau international comme étant critiques pour l’évaluation des nouveaux vaccins RSV à l’avenir.
Introduction
Virus respiratoire syncytial (VRS) est la principale cause des infections des voies respiratoires basses dans la population pédiatrique dans le monde1. Malgré son poids élevé, il n’existe encore aucun vaccin ou traitement. Depuis 2013, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré au point de vaccins RSV comme une priorité de recherche majeur, avec des réunions de la consultation de WHO annuel2,3. L’OMS a convenu sur l’utilisation de RSV neutralisant la mesure des anticorps (NAb) pour surveiller l’immunogénicité des vaccins, comme cela est reconnu comme le marqueur sérologique maj....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Remarque : Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte BSL2 à moins d’indication contraire. Titrage viral est requis avant un test PRN pour déterminer la concentration optimale de RSV, utilisée dans l’essai de PRN. Il est recommandé de la partie aliquote les stocks de virus dans un petit volume qui sera décongelé une fois et utilisés pour chaque dosage NAb. À l’aide de la même souche virale pour toutes les analyses de NAb exécutées pour tous les échantillons provenant d’une étude est également recommandée. Veillez à ce que les milieux de culture et de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est chauffé à 37 ° C avant d’ajouter au....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le titrage d’un stock de virus a été réalisé à partir de 01:10 à 01:108 dilution pour déterminer la concentration de virus stock avant l’essai PRN (résultats représentatifs illustrés à la Figure 5). De la Figure 5, PFU peut compter sûrement à des dilutions de 01:104 et 01:105. Le nombre moyen de PFU de puits en triple à la même dilution a été calculé. Depuis le nombre moyen de taches à 01:10 dilut.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous avons développé et optimisé un test de micro-neutralisation de la RSV simple et efficace qui peut être facilement adapté à la plupart des laboratoires. Ce test est capable de mesurer la capacité d’infection virale ainsi que l’inhibition de l’infection virale par NAb au niveau cellulaire à l’aide de balayage d’image informatisée de mesure. L’utilisation d’une plateforme d’imagerie et systèmes de base d’anticorps spécifiques a augmenté la spécificité et la sensibilité de détection tache par rapport à la plaque traditi.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient tous les participants impliqués. Nous reconnaissons programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure. PVL est une NHMRC carrière développement bourse bene.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
General Consumables
Sérum de veau fœtal (stocké dans 50 mL d’aliquotes à -20 ° ; polyclonal humain Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro Technologies FAL352070 Unité de filtration 0.22 &mu ; Pipette à pointes Pipette à pointes Pipette à pointes
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | fourni par le Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | numéro de lot 60430286 |
| Reagents | |||
| Acétone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor âne anti-chèvre IgG (stockée à 4 ° ; C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sel de sodium en poudre | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (sans sérum, 3,7 g/L NaHC, P/S) (stocké à 4 ° ; C) | Services scientifiques &ndash ; Culture tissulaire | MCRI dans la fourniture maison | |
| C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV anticorps antisérum | Merck | AB1128 | |
| contre le virus respiratoire syncytial (VRS) (stocké dans 45 & micro ; L aliquotes à -20 ° ; C) | BEI Resources | NR-4022 | Commande gratuite via BEI Resources sur inscription. Ce sérum fait partie d’un panel d’antisérum humain et d’immunoglobulines contre le VRS (NR-32832) |
| M199 poudre | Life Technologies | 31100035 | |
| solution bloquante de diluant de lait (stockée à 4 ° ; C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Pénicilline/Streptomycine (stocké dans des aliquotes de 6 ml à -20 ° ; C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O de Milli-Q distributeur | Merck | Distribution interne | |
| Stérile 1x PBS pour la culture (stocké à 4 ° ; C) | Services scientifiques &ndash ; Culture tissulaire | MCRI en alimentation maison | |
| m (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Tubes Eppendorf stériles (1,5 mL) | Australie PL | AM12400 | |
| Plaques stériles à fond plat (96 puits avec couvercle) | Interpath | 655180 | |
| Plaques stériles à fond en U (96 puits avec couvercle) | Interpath | 650180 | |
| Pipette sérologique 5 mL | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| Pipette sérologique 10 mL | Interpath | 607180 | |
| Pipette sérologique 25 mL | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Pipette à pointe 1-200 µ ; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisé 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| 5-20 µ ; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisé 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| 100-1 000 & micro ; LClear Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisé 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| 1-10 & micro ; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-stérilisé 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipements et logiciels | |||
| ELISpot | système de lecteur AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasbourg, Allemagne | ||
| Logiciel AID ELISpot version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasbourg, Allemagne | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Références
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
