Her beskriver vi hvordan du bruker den automatiserte screening og postalternativer for datainnsamling tilgjengelig på noen synchrotron beamlines. Forskere sende cryocooled prøver å synchrotron, egenskapene Diffraksjon er vist, datasettene er samlet inn og behandlet og, om mulig, en struktur løsning er utført – alt uten menneskelig inngripen.
Høy-glans X-ray bjelker kombinert med automatisering har ført til bruk av synchrotron-baserte macromolecular Røntgenkrystallografi (MX) beamlines for selv de mest utfordrende prosjektene i strukturell biologi. De fleste anlegg krever imidlertid fortsatt tilstedeværelse av en forsker på området for å utføre eksperimenter. En ny generasjon av automatiske beamlines dedikert til helautomatisk karakteristikk av og datainnsamling, krystaller av biologiske makromolekyler har nylig blitt utviklet. Disse beamlines representerer et nytt verktøy for strukturelle biologer til skjermen resultatene av første krystallisering prøvelser og/eller samlingen av store antall Diffraksjon datasett, uten brukere å kontrollere beamline seg selv. Her viser vi hvordan du setter opp et eksperiment for automatisk screening og datainnsamling, hvordan et eksperiment er utført på beamline, hvor de resulterende datasettene er behandlet, og hvordan, når krystallstruktur av den biologiske Makromolekyl er løst.
Avgjøre tredimensjonale strukturen i spesifikke proteiner er avgjørende i biologi. Informasjonen som er avledet fra gjør så kaster lys på den biologiske funksjonen og form og spesifisitet av aktiv og/eller bindende områder i molekylet under studien. I mange tilfeller kan dette virkningsmekanismer bestemmes eller, eventuelt, potensielle terapeutiske molekyler utvikles. MX er teknikken brukes vanligvis til å få strukturinformasjon, men en flaskehals bestemmelse av de optimale forholdene å få godt diffracting krystaller. Derfor krystallisering forsøk er gjennomført i mange ulike forhold og er deretter screenet, for å finne de beste krystallene brukes for Diffraksjon datainnsamling. Automatisering av oppsettet av krystallisering forsøk1 har klart bidratt i denne forbindelse. Men utføres de påfølgende trinnene (dvs. krystall montering, Diffraksjon screening og Diffraksjon datainnsamling) vanligvis manuelt, tar opp mye tid, krefter og ressurser. Automatisering av Diffraksjon screening og datainnsamling, derfor betyr en enorm gevinst og effektivitet.
Diffraksjon screening og datainnsamling i MX utføres ofte på synchrotron MX beamlines som automatisering i stor grad har tilrettelagt denne prosessen. Men i de fleste tilfeller er det nødvendig for vitenskapsmannen finnes på beamline under et eksperiment eller fungere det eksternt. Nylig har en ny generasjon av fullstendig automatisert MX beamlines vært utviklet2. Her, trenger brukerne ikke å være tilstede, enten fysisk eller eksternt under en eksperimentell. Dette gjør at forskere til å bruke mer tid på mindre rutineoppgaver, i stedet tilbringe hele dager, og ofte netter, screening krystaller og Diffraksjon datasamling. Verdens første helautomatiske beamline er svært automatisert eksempel integrert Fasilitet for valg (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 på europeiske Synchrotron stråling anlegg (ESRF). Den har et unikt utvalg miljø som en høykapasitets eksempel inneholder dewar opererer i tandem med en robot eksempel veksler som også fungerer som den beamline goniometer4,5. MASSIVET-1 er en undulator beamline utstyrt med en enkelt-fotonet-telling hybrid pixel detektor6, som opererer på en bestemt bølgelengde på 0.969 Å (12.84 keV) med en intens røntgenbilde stråle (2 x 1012 fotoner/s). Strålen størrelsen på prøveposisjon kan justeres mellom minimum 10 µm (runde strålen) til maksimalt 100 µm x 65 µm (vannrett etter vertikale strålen størrelse). I gjennomsnitt kan av beamline behandle, i en helt automatisk mote (se nedenfor), 120 krystaller i 24. Driften av beamline er basert på en rekke arbeidsflyter7hver tar intelligente beslutninger basert på utfallet av trinnene i arbeidsflyten slik måling av best mulig dataene fra prøven under studien. Spesielt evalueringen Diffraksjon kjennetegner en enkelte eksempel tar konto krystall volum og fluks og sikrer, der krystallen er større enn røntgenbilde stråle, at bare den beste regionen krystall brukes for etterfølgende data samling. Diffraksjon datasett er dermed optimalisert for maksimal oppløsning med minimerte stråling skader2,3. Krevende data samling protokoller som pseudo spiralformede (multi-posisjon) data samling strategier for både innsamling av innfødte og enkelt-bølgelengde uregelrett Diffraksjon (SAD), er også tilgjengelig8.
Helt automatisk eksperimenter på MASSIF-1 involverer cryocooling og montering krystaller på en magnetisk eksempel festet passer for ønsket beamline utstyr standard pinnene RYGGRADEN9inn ønsket eksperimentelle parameterne i den ‘ Diffraksjon plan’ tabell i integrerte systemet for Protein krystallografi beamlines (ISPyB)10, en web-basert informasjon styringssystem for MX eksperimenter, og sende prøvene til beamline. På ESRF, alle kostnader for transport av prøvene til/fra beamline støttes av ESRF bruker Office (se nettstedet til ESRF11 for detaljer). I MASSIVET-1, ingen restriksjoner på loop størrelsen eller krystall kvalitet. Når du velger en Diffraksjon plan for en gitt krystall, kan brukeren enten bruke standardinnstillingene eller velg bestemte arbeidsflyter, som kan tilpasses for hvert utvalg. Flere forhåndsprogrammerte arbeidsflyter er tilgjengelige. MXPressE3 i arbeidsflyten justeres først prøve inneholder løkken til prøveposisjon bruker optisk sentrering. Deretter sikrer X-ray-baserte sentrering at den beste delen av krystallen er sentrert av X-ray strålen. Data samling strategier beregnes deretter ved hjelp av eEDNA, et rammeverk for å utvikle plugin-baserte programmer spesielt for online dataanalyse i feltet X-ray eksperimenter tar konto krystall volum og sanntid fluks på beamline. Etter samlingen til en full Diffraksjon datasett, dette behandles deretter bruke en serie med automatisk databehandling rørledninger12 og resultatene er gjort tilgjengelig for inspeksjon og nedlasting i ISPyB. MXPressE SAD3 arbeidsflyten er rettet mot selenomethionine inneholder krystaller av målet protein og utnytter det faktum at operativsystemet energien i MASSIF-1 er like over Se K kanten. Her MXPressE eEDNA dataene samling strategi er optimalisert for trist datainnsamling (dvs. høyt redundans, og med oppløsning satt til der Rflettingen mellom Bijvoet par er under 5%). Til skjermen Diffraksjon egenskapene for en rekke krystaller uten etterfølgende datainnsamling, kan MXScore3 arbeidsflyten brukes til å produsere en full kvalitetsvurdering av krystallene analysert. MXPressI3 i arbeidsflyten samles 180 ° rotasjon data bruke 0,2 ° svingninger og start phi vinkelen og oppløsningen bestemmes av en eEDNA strategi. MXPressO 3 inneholder en preobserved oppløsning i arbeidsflyten (standard: dmin = 2 Å). For å gjøre en innledende vurdering av krystaller som resulterer fra en krystallisering rettssaken, tilbys MXPressM3 arbeidsflyt. Dette utfører en høy dose mesh avsøke over bredeste retningen for eksempel støtte med ingen datainnsamling eller sentrering. To nye eksperiment arbeidsflyter, MXPressP og MXPressP_SAD, som utfører pseudohelical data samlinger, har nylig vært gjennomført8. Av alle trinn i alle arbeidsflyter kan følges online og i sanntid av brukeren, via ISPyB.
Her viser vi hvordan å forberede et helautomatisk MX eksperiment MASSIF-1 og å hente og analysere dataene som følge av eksperimentet. Som et eksempel bruker vi menneskelige mitokondrie glysin cleavage systemet protein H (GCSH). Dette lipoic syre inneholder proteinet er del av glysin cleavage systemet er ansvarlig for nedbrytning av glysin. Denne system inkluderer P protein, en pyridoxal fosfat-avhengige glysin dekarboksylasehemmer, T protein, en tetrahydrofolate-krever enzym og L protein, en lipoamide-dehydrogenase. GCSH overfører gruppen methylamine glysin fra P protein til T protein. Feil i H protein er årsaken til nonketotic hyperglycinemia (NKH) i Human13.
Helautomatisk beamlines gir automatisert karakterisering og datainnsamlingen fra et stort antall macromolecular krystaller uten tilstedeværelse forsker, enten på beamline eller eksternt, som krevde. Bruke fullstendig automatisert beamlines har mange fordeler i forhold til manuell drift. For eksempel, automatisert prøven sentrering, basert på X-ray mesh og line skanner, mer presis enn med det menneskelige øyet som påvirkes den ikke av termisk eller optiske effekter. Faktisk disse mesh og line skanner gi ekstra informasjon (dvs. detaljert dimensjoner krystall og best diffracting regionen av crystal) som er viktig å bestemme riktig strålen størrelsen du bruker til datainnsamling-spesielt for små krystaller 18– og fører ofte til en forbedret kvaliteten på innhentet Diffraksjon dataene. Videre ved å utnytte de brukerdefinerte parameterne i oppsettet automatisk eksperimenter, kan trinnene i bestemte arbeidsflyter skreddersys for å passe systemet under studien, dermed ytterligere optimalisering eksperiment suksessraten.
Tar sammen, påliteligheten av arbeidsflyter tilgjengelig, enkel tilgang til beamline (brukere selv planlegge, bruke en kalender [se ovenfor]), og den helautomatiske tilnærmingen av MASSIF-1 gir et grundig, høy gjennomstrømming og tidsbesparende alternativ til klassisk hands-on MX eksperimenter og potensial til å implementere mer avanserte prosedyrer og programmer i automatisk arbeidsflyter. I nær fremtid, iverksettes crystal kartografi i 3D19 for å forbedre nøyaktigheten av X-ray sentrering, mens mer komplekse protokoller som krystall dehydrering eksperimenter20, automatisert. Håpet er at fullstendig autonome datainnsamling vil bli en standard metode i MX, gir høy kvalitet data for små molekyl fragment skjermer, optimalisere screening av store antall dårlig diffracting krystaller og automatisk gir fase informasjon å løse krystall strukturer de novo. I kombinasjon med utviklingen i den automatiserte høsting krystaller21, muligheten for protein krystall struktur løsning som en automatisert tjeneste kan godt bli en realitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker ESRF for beamtime.
Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Dnase | Roche | 11284932001 | |
DTT | Euromedex | EU0006-B | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
loop | Hampton Research | HR8-124 | |
lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
Programs: | |||
MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
BES workflow server | Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012). | ||
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
BLISS beamline control | Guijarro, M. et al. BLISS – Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018). | local development | |
AUTO processing of images | Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013) | local development | |
BEST and EDNA | Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009). | local development | |
CCP4 | Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011). | ||
Phaser MR | McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007). | ||
Coot | Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004). | ||
refmac5 | Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240–255 (1997). | ||
Matthews | Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968). |