Neuronal excitabilitet kan moduleras genom en dynamisk process av endo- och exocytos av excitatoriska jonotropa glutamatreceptorer. Beskrivs här är tillgänglig, hög-innehåll test för kvantifiering av ytan och inre receptor populationer.
Postsynaptiska människohandel receptorer till och från cellytan är en viktig mekanism som nervceller modulera deras lyhördhet för olika stimuli. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA)-receptorer, vilka är ansvariga för snabbt excitatoriska synaptisk transmission i nervceller, smugglas till och från den postsynaptiska ytan att dynamiskt ändra neuronal excitabilitet. AMPA receptor människohandel är viktigt för synaptisk plasticitet och kan störas vid neurologisk sjukdom. Dock vanligare metoder för kvantifiering av receptorn människohandel ignorera hela receptor pooler, är alltför tid – och arbetsintensiva, eller störa normala människohandel mekanismer och därför komplicerar tolkningen av resulterande data. Vi presenterar en hög-innehåll analysmetod för kvantifiering av både ytan och inre AMPA receptor populationer i odlade primära Hippocampus nervceller med dubbla fluorescerande immunolabeling och nära infrarött fluorescerande 96 brunnar mikroplattan skanner. Detta tillvägagångssätt underlättar snabb screening av bulk internaliserat och ytan receptor tätheter samtidigt minimera provmaterial. Vår metod har dock limitationsin erhålla encelliga upplösning eller genomföra levande cell imaging. Detta protokoll kan slutligen vara mottagliga för andra receptorer och olika celltyper, förutsatt att rätt justeringar och optimering.
Omfattningen och tidsmässiga dynamiken i neuronal excitabilitet är till stor del beroende av tillgången till och sammansättning av surface receptor populationer som transduce elektrokemiska signaler. Syntes av nya receptorer (eller receptor subenheter) är generellt ett energiskt kostsam och relativt utdragna process, en mängd cellulära maskineriet tillägnad endo- och exocytos av befintliga receptorer ger ett sätt för deras snabbt införande och borttagning till och från membran1. Därför, förutom transkriptionell och translationell regleringen av receptorer, posttranslationell receptor människohandel är en viktig modulator av neuronal excitabilitet.
Synaptisk plasticitet, eller ändra styrkan av anslutningar mellan nervceller med erfarenhet, är tänkt att utgöra grunden för inlärning och minne2,3. Förstärkning och försvagning av synapser över tid, kallas långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD), respektive kan moduleras genom handel med α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) receptorer 4 , 5. AMPA-receptorer är heterotetramers består av fyra subenheter (GluA1-4), och medla majoriteten av snabbt excitatoriska synaptisk transmission i hjärnan6. Neuron retbarhet alltså till stor del en funktion av mängden AMPA-receptorer på postsynaptiska yta tillgänglig för att aktiveras av glutamat. LTD är ofta förknippad med en ökning av AMPA receptor endocytos, LTP är huvudsakligen associerade med en ökning av AMPA receptor exocytos. Postsynaptiska ytan uttryck av AMPA-receptorer kräver endosomal leverans till exocytotic proteiner, där fusion med plasmamembranet sedan inträffar i en kalcium-beroende sätt7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. det finns också en mängd mekanismer som reglerar aktiviteten-beroende AMPA receptor endocytos. Ett exempel på detta är via den omedelbara tidiga genen Arc/Arg3.1 (Arc). Bland andra funktioner15, Arc är känt att medla metabotropa glutamat receptor (mGluR)-beroende LTD genom att främja AMPA receptor endocytos genom dess bindande partner, som inkluderar endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 och dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, vid clathrin-belagda gropar20,21. Internaliserad AMPA-receptorer kan antingen återvinnas tillbaka till plasmamembranet eller öronmärkt för nedbrytning22,23.
Ännu viktigare, bidrar subenhet sammansättningen av AMPA-receptorer till deras människohandel dynamics24. Av större betydelse är den intracellulära C-terminal domänen av subunitsna, där majoriteten av posttranslationell modifieringar och människohandel-relaterade proteininteraktioner inträffar. GluA1 och GluA4 subunit-innehållande AMPA-receptorer är särskilt benägna att vara människohandel till cellytan under LTP, delvis på grund av deras PDZ ligander, ~ 90 amino syra ordnar som främjar membran förankring via interaktioner med olika PDZ domän-innehållande proteiner25,26. Däremot, tenderar AMPA-receptorer som innehåller GluA2 och saknar GluA1 eller GluA4 att vara människohandel konstitutivt men ackumuleras intracellulärt med synaptisk aktivitet27. GluA2 subenheter genomgå RNA redigering som, förutom att främja bevarande i endoplasmatiska retikulet28återger kanal pore ogenomtränglig för kalcium29, ytterligare ifrågasätta subunit-specifika människohandel som en central förmedlare av neuronala homeostas och plasticitet. Intressant, har störningar av ubiquitin-beroende Arc nedbrytning visat sig öka GluA1 endocytos och öka ytan uttrycket av GluA2 subunit-innehållande AMPA-receptorer efter induktion av mGluR-LTD med den selektiv grupp I mGluR-agonist (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), som anger att mycket återstår läras om mekanismer och roll subunit-specifika AMPA receptor människohandel30.
Metoder för att följa förändringar i ytan uttryck av receptorer är ofta besvärliga, tidskrävande eller införa onödiga förvirrar. Biotin-baserade analyser finns en genomgripande och kommersiellt tillgänglig metod. Affinitet rening av biotinylerade yta receptorer representerar ett sådant exempel, men behovet av utför elektrofores kräver en stor mängd provmaterial och kan återge screening av flera behandlingar ett oöverkomligt långa bearbeta31. Förlängningar av denna analys, där flera tidpunkter av etiketterings- och immunoprecipitations utförs för att kvantifiera den gradvisa nedbrytningen av en första signal, på samma sätt försumma tillägg av nya — eller återvunnet — receptorer på cellens yta och bara förvärra tid och materialbehov.
Andra tillvägagångssätt gör användning av chimära konstruktioner eller tillägg av fluorescerande Taggar att iaktta receptor människohandel32, ibland med levande cell imaging33,34. Medan potentiellt kraftfulla, kan dessa mönster påverka de normala människohandel mönster av receptorer beror på mutationer eller dramatiska förändringar infördes i dessa proteiner med molekylvikt. Användning av färgämnen att etiketten subcellulär fack genom att rikta lågt pH34,35 är ospecifika och göra åtskillnad mellan olika intracellulära fack viktigt för receptorn människohandel (e.g. lysosomer och proteasomen) svårt. Slutligen, användning av konfokalmikroskopi att visualisera colocalization av receptorer med markörer associerade med människohandel och nedbrytning, såsom endosomal proteiner eller clathrin, samtidigt som potentiellt användbar insikt i specifika lokalisering med subcellulär upplösning, är tid, arbetskrävande och kostsam på grund av nödvändigheten av att individuellt analysera varje cell och kravet på confocal eller super-resolution mikroskopi.
Här visar vi en hög-innehåll receptor människohandel analysmetod som är kompatibel med neuronala primärkulturen preparat30. Denna metod etiketter separat yta och intracellulära receptorn pooler av fasta nervceller, möjliggör en presentation av uppgifter i förhållande till normaliserade yta eller internaliserade täthet till totala tätheten för denna receptor. Hög-innehåll arten av denna metod är idealisk för screening flera behandlingar och/eller genotyper i en kort tid, och kräver endast standard cellen odling och antikropp inkubation expertis.
Kort, primära nervceller odlas i standard 96 brunnar mikroplattor och sedan behandlas som dikteras av experimentell design, inkuberas med primära antikroppar, tvättas och fast. Cellerna inkuberas därefter med en sekundär antikropp att märka yta receptorer, följt av en annan fixering steg. Vilket sedan inträffar och en andra sekundär antikropp används för att märka inre receptor pooler. Slutligen är celler avbildas med hjälp av en infraröd fluorescerande mikroplattan scanner för att kvantifiera integrerad tätheten av varje receptor befolkningen. Figur 1 sammanfattar våra high-innehåll assay jämfört med en traditionell biotinylation analys.
Medan protokollet erbjuds här är optimerad och specifika för AMPA receptor människohandel primära Hippocampus neuron kulturer, proceduren kunde, i teorin, utökas och anpassas för olika receptorer i en mängd olika celltyper.
AMPA-receptorer är ett jonotropa glutamat receptor subtyp som är integrerad för neuronala funktioner som inkluderar synaps bildas, synaps stabilitet och synaptisk plasticitet. AMPA receptor störningar är kopplad till flera neurologiska24 och anses attraktiva drog mål40. Studier har exempelvis visat att en av de tidigaste tecknen på Alzheimers sjukdom (AD) är synapse förlust och minskat synaptic AMPA receptor nivåer41,42. Spännande, försämrar tillägg av Amyloid-ß oligomerer surface GluA1-innehållande AMPA receptoruttryck vid synapser43. Ytterligare, status epilepticus down-reglerar GluA2 mRNA och protein i hippocampus nervceller före sin död44. Amyotrofisk lateralskleros (ALS), tjära DNA-bindande protein (TDP-43) patologi, en ALS-specifika molekylära abnormitet, har varit kopplade till ineffektiva GluA2 Q/R webbplats-RNA redigering45.
Hög-innehåll AMPA receptor människohandel analysen ger ett effektivt medel för att mäta massredigering i receptorn människohandel profiler inom ett neuronala nätverk svar på olika faktorer, förbrukar mycket mindre tid och material än alternativa metoder. En enda 96 brunnar mikroplattan ger många brunnar för att köra flera tekniska replikerar och kontroller för olika experimentella förhållanden i samma platta. Låg plätering tätheten av 2 x 104 celler per brunn i förhållande till 5 x 105 celler per brunn densiteten minskar avsevärt antalet djur och material som krävs för varje experiment (figur 1). Infraröd skannern kan bilden upp till sex 96 brunnar mikroplattor i taget. Analysen kan också ändras till en 384-väl mikroplattan46, som blir särskilt värdefulla om analysen körs på dyrbara prover som är svårt att få eller är dyra att kultur (t.ex. mänskliga prover och inducerade pluripotenta stamceller). Hela analysen kan fyllas i och analyseras samma dag, vilket sparar värdefull tid (figur 1).
För framgångsrika och effektiva komplettering av analysens måste några punkter beaktas. Först, är det viktigt att förbereda DHPG lösningen på den samma dagen av neuron behandling. Inte återanvända eller frysa DHPG bestånd. 4% paraformaldehyde/4% sackaros i PBS lösning bör också göras färsk samma dag av experimentet. Det andra kontrollbrunnar behandlas med TTX endast eller fordon är skyldiga att säkerställa att de effekter som observerats är specifika för behandling. Det är också viktigt att inkludera brunnar som behandlats med endast de sekundära antikropparna mot kontroll för bakgrunden fluorescens produceras av icke-specifik bindning. Observera att fixering steg (följande bortspolning av sekundära antikroppar) är nyckeln till att minska sekundär antikropp bakgrundseffekter och uppnå effektiv märkning av receptorn subenheter.
Kompromisser och begränsningar, finns som med någon metod. Denna analys ger inte encelliga (eller subcellulär) upplösning och tillåter inte för realtidsspårning av receptorn människohandel som andra metoder32,33,35. Dessutom måste korrekt vara försiktig under vilket steg av nervceller, eftersom denna metod kommer att vara känsliga för läckage av intracellulära komponenter när det gäller alltför permeabilisering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Zachary Allen för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av stiftelsen Whitehall (Grant 2017-05-35) och Kleon C. Arrington inledande Grant forskningsprogram (RIG-93) till ask. M.A.G. och D.W.Y. var båda stöds av ett Georgia State University Neurogenomics 2CI stipendium.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |