細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析
Summary
このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル システムとしてマウス新生児心筋細胞を使用する方法を説明するためにです。
Abstract
ミトコンドリアおよび酸化的代謝心臓筋肉の機能を維持するために重要です。研究は、心不全、心臓機能障害の重要な要因のミトコンドリアの機能低下を示しています。対照的に、不良ミトコンドリア機能を復元すると、失敗した心における心機能の改善に有益な効果があります。したがって、調節のメカニズムを勉強して、ミトコンドリア機能の新しい調節の識別は、心臓病の治療のための新しい治療上のターゲットを開発するために使用可能性があります洞察力を提供できます。ここでは、ユニークな細胞培養系を用いた心筋細胞のミトコンドリア呼吸を分析します。まず、プロトコルは急速に分離し、高生存率新生児マウス心筋細胞の培養に最適化されています。その後、96-well 細胞フラックス アナライザーを使用してこれらの心筋の酸素消費量を評価します。このプロトコルの播種条件を最適化し、示した細胞フラックス アナライザーでその新生児マウス心筋酸素消費量を簡単に評価できます。最後に、我々 は大きく文化に私達のプロトコルを適用できるし、他の研究は、細胞内シグナル伝達などと収縮機能解析を注意してください。
Introduction
連続的な心臓の収縮機能を維持するために、心筋細胞は ATP1の形で主に細胞のエネルギーの安定供給を維持しなければなりません。中心部には、ATP の約 95% はミトコンドリア酸化的リン酸化、ミトコンドリアが心機能2,3で重要な生体エネルギーの役割を再生表示を中心にによって生成されます。この概念を支えるは、ミトコンドリア機能の不全心筋症や心不全の4,5につながることができます。逆に、失敗の心機能を改善するために示されているミトコンドリアの機能を復元する6、7の心します。したがって、ミトコンドリアのエネルギー代謝のメカニズムを勉強して、心筋細胞のミトコンドリア機能の新しい調節を識別する心臓エネルギーの生産の機械論的な洞察力を明らかにはしない、またつながる洞察力を提供できます。心疾患6,8の治療に新しい治療上のターゲットの開発。
心臓全体と比較して、非常に純粋な非筋細胞線維芽細胞や血管内皮細胞10など、心の底からの雑菌は心筋細胞と非筋細胞9、心筋細胞文化の混合物が含まれています。さらに、新生児の子犬から心筋細胞を分離する大人の心10,11から分離する細胞と比較して時間の少量の細胞の数が多いを養殖できます。最も重要なは、一次培養アダルト マウス心筋細胞 (例えば 24 h) 回生存期間が短縮、長い時間でポイントが逆差別化します。新生児マウス心筋細胞は生き残ることができる、7 日間の培養、心筋細胞10薬剤化合物とミトコンドリアの機能に関する遺伝子操作の効果をテストに最適な上向きの操作します。もちろん、成人と新生児の細胞の重要な生物的違いがあるが、新生児の細胞の培養のため長い期間使用可能なため、ミトコンドリア機能のそれらを含む研究の多くの異なる種類の適切です。
までに、一次培養新生児マウスおよびラットの心筋細胞は、心臓の生体エネルギー12,13を研究するモデルとして使用されています。近年では、研究は酸素消費量 (OCR) を測定し、マウスおよびラット新生児心筋細胞14,15酸化能力を評価する細胞フラックス アナライザーを使用しました。一方、ラットと比較して、マウス新生児心筋細胞の細胞生存率が低い、大きい変動16です。また、遺伝子改変マウスのモデルから細胞を調査する機能はマウス細胞モデルを非常に重要ななります。OCR 研究が細胞数および播種密度に敏感、一貫性のある細胞収量および生存率を達成するために再現性のある、信頼性の高い、簡単なプロトコルの開発が必要です。
ここでは、OCR 解析 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザーと共に培養マウス新生児心筋細胞を使用して開発されている最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、アッセイの再現性を大きく向上します。また、プロトコルだけでなく小説や OCR 分析の再現性のある方法を提供がも、筋原繊維機能を研究するために必要と細胞内となるよう、他の実験目的のためはより大きいサイズの文化に適応することができます。シグナル伝達経路。
特に、このプロトコルは 96-well 細胞培養プレート新生仔マウスにおける心筋細胞の分離と培養の 1 日プロシージャを記述します。さらに、それは細胞外フラックス アナライザーを使用して酸素消費量を測定する手順を説明します。使用されるすべてのソリューションが滅菌、滅菌フィルタ リングします。すべてのツールは、75% エタノールで滅菌されています。プロシージャのさまざまな部分の材料のテーブルを提供します。心筋細胞を培養するためすべての手続きや手順は、標準セル文化フードで実行されます。このプロトコルは、1 リットル (約 8-10 子犬) から新生児マウス心を分離するため開発されています。ただし、プロトコルは、複数の仔から心筋細胞を分離するために適応させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、分離すること、マウス新生児心筋細胞を培養するための単純なプロトコルを設けています。これらの心筋細胞を用いて、細胞フラックス アナライザー システムを用いた酸素消費量を測定するための条件も最適化されています。プロトコルでは、そのままの臓器で測定されるものに似ている、心の主作業セルの酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はすべてのロス ラボとマーフィー研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は NIH エンライテンメント (HL115933、HL127806) と R.S.R. に VA メリット (BX003260) アメリカ心臓協会 (14SDG17790005) によってサポートされて
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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