Denne undersøgelse beskriver i detaljer processen af gavaging præcise mængder af probiotika til neonatal mus. Den eksperimentelle set-up var optimeret til at omfatte, men er ikke begrænset til probiotiske dosering, metoder til administration og kvantificering af bakterier i tarmene.
Voksen musemodeller har været udbredt at forstå mekanismen bag sygdomsprogression hos mennesker. Anvendeligheden af undersøgelser udført i voksen musemodeller til neonatal sygdomme er begrænset. For bedre at forstå sygdomsprogression, vært svar og langsigtede virkninger af interventioner i nyfødte, er en neonatal musemodel sandsynligvis en bedre pasform. Den sparsomme brug af neonatal musemodeller kan delvis tilskrives de tekniske vanskeligheder med at arbejde med disse små dyr. En neonatal musemodel blev udviklet til at fastlægge virkningerne af probiotiske administration tidligt i livet og især vurdere muligheden for at etablere kolonisering i nyfødte mus og tarmkanal. Specifikt, for at vurdere probiotiske kolonisering i neonatal musen, blev Lactobacillus plantarum (LP) leveret direkte i neonatal mus mave-tarmkanalen. Med henblik herpå, blev LP administreret til mus ved at fodre gennem intra-spiserøret (IE) sonde. En yderst reproducerbar metode blev udviklet til at standardisere processen med IE sonde, der tillader en præcis administration af probiotiske doser samtidig minimere traumer, et aspekt særlig vigtigt givet skrøbelighed af nyfødte mus. Begrænsninger af denne proces omfatte mulighederne for esophageal irritation eller skade og aspiration hvis gavaged forkert. Denne tilgang repræsenterer en forbedring af nuværende praksis, fordi IE sonde i distale spiserøret reducerer risikoen for aspiration. Efter sonde, var profilen kolonisering af probiotiske spores ved hjælp af kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) af den udpakkede intestinal DNA med LP specifikke primere. Forskellige kuld indstillinger og bur management teknikker blev brugt til at vurdere potentialet for kolonisering-spredning. Protokollen detaljer snørklede af IE neonatal mus sonde og efterfølgende kolonisering kvantificering med LP.
Hos spædbørn, har tidlig probiotiske eksponering været forbundet med immunmodulerende effekt fører til reduceret forekomst af sygdomme som nekrotiserende enterocolitis, atopisk dermatitis og sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bag denne immunmodulerende svar er udfordrende for at udforske givet begrænsning til prøvetagning i nyfødte menneskelige forsøg (dvs., sekventiel blod trækker og biopsier). Neonatal musemodeller kan hjælpe studere virkningsmekanismen involveret i neonatal immunsystemet forordning forbundet med probiotiske brug og ændringer i den tarmens mikrobiota. Desværre, de fleste musemodeller for probiotika har i vid udstrækning fokuseret på voksne mus; men virkningen af probiotika er tilbøjelige til at være højest tidligt i livet, tyder på modeller, der er specifikke for denne aldersgruppe vil være nyttigt3,6. Derudover er neonatal musemodeller bedre egnet til at studere sygdomme og interventioner, som de forventes at mere nøje efterligne en udvikle immun og mikrobielle system7,8 bestemt til anvendelse i tidlige liv i menneskelige spædbørn ,9,10. Formålet var at undersøge omfanget og mønstre af probiotiske kolonisering af neonatal mus med fokus på de mekanistiske samspillet mellem vært og dens microbiome. Passende beskrivelser af nyfødte modeller blev ikke fundet i litteraturen, og dermed et behov for udvikling af robuste og standardiseret metode blev behandlet.
Etablerede metoder til oral administration af forskellige forbindelser til nyfødte mus omfatter maternel overførsel af ønskede forbindelser gennem mælk ved behandling af vandkilde for gravide dæmninger11 eller bruge fodring nåle til at lette administrationen af ønskede forbindelser i oropharynx12. Disse metoder er nyttige for eksperimenter der ikke har præcis dosering krav og hvor behandlingen er let indtages af den modtagende mus. Probiotika er ofte administreres sammen med en prebiotiske såsom galactooligosaccharide og fructooligosaccharide (FOS), der tjener som en kilde til ernæring for probiotiske bakterier; disse tilsætningsstoffer forbindelser gør løsningen tyktflydende og udfordrende at administrere via de ovennævnte metoder. Udtænke en metode til at administrere præcise mængder af probiotika og prebiotics til nyfødte mus starter så tidligt som den første dag i livet (DOL) var nødvendigt. Ved at udvikle sonde teknik, muligheden for kolonisering-spredning (som observeret i andre probiotiske undersøgelser mellem behandling og kontrol arme13,14,15,16) blev testet og den relative forekomst af koloniseret Lactobacillus plantarum (LP) i tarmene af unger med forskellige sonde tidsplaner blev vurderet. Probiotiske forberedelse af forsøgsdyr bestod af 109 kolonidannende enheder (CFU) pr. sonde af LP (ATCC-202195 stamme), blandet med FOS (prebiotiske) og maltodextrin (hjælpestof) som beskrevet i den seneste menneskelige forsøg3. Probiotiske levering blev udført ved hjælp af IE sonde og processen er udførligt beskrevet i protokollen nedenfor. Profilen kolonisering af probiotiske blev evalueret ved hjælp af realtid forstærkning af DNA ekstraheret fra hele tarmen ved hjælp af LP specifikke primere.
Proceduren for IE sonde blev udviklet for at sikkert administrere en bestemt dosis af en probiotisk til neonatal mus. Små mængder af væske er leveret til den øvre mave-tarmkanalen ved hjælp af en fodring nål til at forhindre aspiration samtidig sikre levering af doseringen i tillid. Tarme af mus blev indsamlet for kolonisering analyse to og seks dage efter sonde. Proceduren for DNA-ekstraktion blev ændret for at sikre højt udbytte af probiotiske Gram-positive organismer. QPCR analyse af DNA udvundet to dage post sidste sonde viste relativt højere kolonisering af LP i mus gavaged hver to dage i forhold til mus gavaged hver dag mellem DOL 2-8. Der var også et fald i mængden af LP over seks dage, viser denne probiotiske er en forbigående organisme i tarmen af musen. Resultaterne af disse eksperimenter fastsætte betingelser til at gennemføre forskning med høj stringens i denne aldersgruppe.
For at overholde de langsigtede virkninger af probiotika i neonatal mus, blev det administreret til neonatal mus på DOL 2; en lignende starttidspunkt pege på den humane forsøg. Oropharyngeale fodring af neonatal mus er tidligere beskrevet i litteraturen og foretaget kun efter DOL 5-812,17 , når risikoen for aspiration er lavere på grund af et veludviklet synke mekanik. Dog er oropharyngeale fodring ikke velegnet til DOL 2 mus, som højere satser for aspiration blev observeret i pilotundersøgelse (data ikke vist). Den tyktflydende karakter af probiotiske og prebiotiske løsningen føjes til risikoen for aspiration. Proceduren IE gavaging minimeres risikoen for aspiration i DOL 2 mus samtidigt med at levere den ønskede mængde direkte til den øvre mave-tarmkanalen. Resultat af indgrebet var først valideret ved hjælp af levnedsmiddelfarvestof infunderes probiotiske sonde. Mad farve fungerer som en markør, der er synlige gennem huden af pup. Ingen negative effekter blev observeret i mus gavaged med frugtfarve, og det anbefales at validere gavaging procedure på denne måde før påbegyndelse storskalaforsøg. Den hurtige opløsning på den gispende refleks set post sonde kan også bruges som en yderligere indikator for en vellykket sonde. Når musen er placeret på den varme tæppe efter sonde, den gispende refleks vil stilne og en stigning i vejrtrækning frekvens vil være observeret inden for 20 sekunder. Fortsættelse af den gispende refleks for længere end 30 sekunder angiver en mislykket sonde. Vellykket sonde afhænger også passende indsættelse af fodring nålen med pæren sidder lige over åbningen af den kardiale sphincter af maven. Dette kan fremmes ved at sikre, at mærkningen på nålen længdemåling mellem formet som et sværd proces og spidsen af snuden, ikke går forbi Snuden af musen under sonde. Dette minimerer risikoen for skade at musen. Hyppigheden af sonde kan have en betydelig indvirkning på de eksperimentelle resultater. Hyppige gavaging kan også oprette mere stress til unger og mor på grund af konstant undertrykkelse af netbårne buret og reden. Den mest optimale sonde tidsplan er når gavages er den mindst hyppige og over en kortere varighed uden at miste den forventede virkning i systemet. For at sikre sikkerhed og sterilitet i proceduren sonde skal nålen steriliseres ved vask og autoklavering imellem brug. Vask grundigt på udefra med et krat og indersiden ved at tvinge vand gennem nålen ved hjælp af en sprøjte, før autoklavering er nødvendige som enhver sidesten partikler kan encrust på nålen under autoklavering og kan forstyrre gavaging procedure.
Højere LP kolonisering blev observeret i unger, der var gavaged hver anden dag i forhold til unger gavaged hver dag. Dette kan skyldes nedsat stress på unger gavaged hver anden dag og potentielt probiotiske får flere næringsstoffer gennem relativt mere mælken indtages af disse unger. Dosis afhængighed af probiotiske behandling har været tidligere studeret i mus modeller18,19 og administrationen af korrekt dosering er derfor vigtigt. De probiotiske rengøringsopløsning er forgyldt før hver sonde til at få en præcis optælling af CFU administreres. Hvis probiotiske organismen er anaerobt, er det vigtigt at se om der er forskel i CFU når kulturperler aerobt eller anaerobt. Da LP er en fakultativ anaerobe, det var kulturperler, med begge metoder og ingen forskel i CFU blev observeret.
Post sonde intestinal LP load analyse blev udført ved hjælp af qPCR og høj kvalitet DNA-prøver. For at minimere LP DNA forurening mellem behandling og kontrolgrupper, forskellige fodring nåle, biosikkerhed kabinetter og kirurgisk udstyr blev brugt til at sikre højeste kvalitet prøver. Nøjagtig måling af probiotiske i tarmen kræves en optimeret DNA ekstraktion metode. Mest effektive metoder til udvinding af DNA fra afføring indebærer flere perle slå trin20,21,22. Denne metode blev vedtaget for udvinding af tarmbakterier bruger perle bankende og observeret formindsket repræsentation (< 102 eksemplarer genvundet) af LP i den hele tarmen DNA-ekstraktion. Som LP er en Gram positive organisme med en betydelig mængde af peptidoglycan i cellevæggen, blev protokollen optimeret med en peptidoglycan opløsning trin ved hjælp af lysozym23,24 tilføjes den enzymatiske lysisbuffer. Denne øgede repræsentation af LP i samme intestinal prøve af større end dobbelt. Lysozym behandling sikrer opløsningen af det yderste lag, mens perle slå trin letter lysering af organismen. Optimering af mængden af væv, granat perle type og varighed af forstyrrelser ved hjælp af perlerne er nødvendige for at opnå optimal DNA produkter for at gennemføre PCR-analyse.
Den positive effekt af probiotika administreret som profylakse eller behandling i de foreløbige sigt og sigt nyfødte er dokumenteret i de seneste undersøgelser25,26,27,28. Etablering af en ordentlig neonatal musemodel for probiotika er berettiget til at pakke den beskyttende effekt af probiotika. Denne protokol her skitserede repræsenterer en vejledning for forskere uvante med neonatal mus arbejde ved hjælp af probiotika. Uanset problemer med gnaver mikrobiota samtidig med at studere menneskers sundhed og sygdom, kan denne metode forlænges til forskning fokuseret på at forstå ændringerne af microbiome på grund af probiotika. Denne model giver også en platform for at studere vært-mikrobe interaktion og immunrespons i løbet af forskellige udviklingsstadier.
The authors have nothing to disclose.
Tak til dyrs pleje facilitet medarbejdere og UBC dyrlæger til træning og bistå med at musen virker på BC children’s Hospital Research Institute. Tak til University of British Columbia og Institut for eksperimentel medicin for finansiering til undersøgelse.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |