यह अध्ययन नवजात चूहों को प्रोबायोटिक्स की सटीक मात्रा gavaging की प्रक्रिया का विवरण । प्रयोगात्मक सेट अप शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन प्रोबायोटिक खुराक, प्रशासन के तरीकों, और आंतों में बैक्टीरिया की ठहराव तक ही सीमित नहीं है.
वयस्क माउस मॉडल व्यापक रूप से मानव में रोग प्रगति के पीछे तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है । नवजात रोगों के लिए वयस्क माउस मॉडल में किया अध्ययन की प्रयोज्यता सीमित है । बेहतर रोग प्रगति, मेजबान प्रतिक्रियाओं और नवजात शिशुओं में हस्तक्षेप के दीर्घकालिक प्रभाव को समझने के लिए, एक नवजात माउस मॉडल की संभावना एक बेहतर फिट है । नवजात माउस मॉडलों के विरल उपयोग भाग में इन छोटे जानवरों के साथ काम करने की तकनीकी कठिनाइयों के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । एक नवजात माउस मॉडल के लिए प्रारंभिक जीवन में प्रोबायोटिक प्रशासन के प्रभाव का निर्धारण और विशेष रूप से नवजात माउस आंत्र पथ में औपनिवेशीकरण स्थापित करने की क्षमता का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था । विशेष रूप से, नवजात माउस में प्रोबायोटिक औपनिवेशीकरण का आकलन करने के लिए, लैक्टोबैसिलस plantarum (एल. पी.) नवजात माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग में सीधे दिया गया था । यह अंत करने के लिए, एल. पी. को इंट्रा-घेघा (आईई) gavage के माध्यम से खिला द्वारा चूहों को प्रशासित किया गया । एक उच्च reproducible विधि IE gavage की प्रक्रिया है कि प्रोबायोटिक खुराकों का एक सटीक प्रशासन की अनुमति देता है, जबकि आघात को कम करने, एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण नवजात चूहे की कमजोरी को देखते हुए एक पहलू को मानकीकरण विकसित किया गया था । इस प्रक्रिया की सीमाएं घेघा जलन या क्षति और आकांक्षा अगर gavaged गलत की संभावनाओं शामिल हैं । इस दृष्टिकोण वर्तमान प्रथाओं पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि बाहर घेघा में IE gavage आकांक्षा की संभावना कम कर देता है । gavage के बाद, प्रोबायोटिक के औपनिवेशीकरण प्रोफ़ाइल एल ई पी विशिष्ट प्राइमरों के साथ मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) निकाली आंत्र डीएनए का उपयोग कर पता लगाया गया था । विभिन्न कूड़े सेटिंग्स और पिंजरे प्रबंधन तकनीक औपनिवेशीकरण-प्रसार के लिए क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रोटोकॉल का विवरण IE नवजात माउस gavage और बाद में एल पी एस के साथ औपनिवेशीकरण ठहराव की जटिलताओं ।
शिशुओं में, जल्दी प्रोबायोटिक एक्सपोजर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ, atopic जिल्द की सूजन और पूति1,2,3, जैसे रोगों की कम घटनाओं के लिए अग्रणी प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है 4 , 5. हालांकि, इस इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रतिक्रिया के पीछे तंत्र नवजात मानव परीक्षणों में नमूना (यानी, अनुक्रमिक रक्त ड्रॉ और बायोप्सी) के लिए सीमा को देखते हुए तलाशने के लिए चुनौतीपूर्ण है । नवजात माउस मॉडल मदद कर सकता है नवजात प्रतिरक्षा में शामिल कार्रवाई के तंत्र का अध्ययन प्रोबायोटिक का उपयोग करें और आंत्र microbiota में परिवर्तन के साथ जुड़े विनियमन । दुर्भाग्य से, प्रोबायोटिक्स के लिए सबसे माउस मॉडल मोटे तौर पर वयस्क चूहों पर ध्यान केंद्रित किया है; हालांकि, प्रोबायोटिक्स के प्रभाव के जीवन में सबसे अधिक जल्दी होने की संभावना है, इस आयु वर्ग के लिए विशिष्ट मॉडल सुझाव3उपयोगी हो जाएगा,6। इसके अलावा, नवजात माउस मॉडल बेहतर रोगों और मानव शिशुओं के प्रारंभिक जीवन में आवेदन के लिए इरादा हस्तक्षेप के रूप में वे और अधिक बारीकी से एक विकासशील प्रतिरक्षा और माइक्रोबियल प्रणाली7,8 नकल की उंमीद कर रहे है अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं ,9,10. उद्देश्य हद तक और नवजात चूहों के प्रोबायोटिक औपनिवेशीकरण के पैटर्न मेजबान और उसके microbiome के बीच यंत्रवत बातचीत पर ध्यान देने के साथ अध्ययन करने के लिए किया गया था । नवजात मॉडलों के उपयुक्त वर्णन साहित्य में नहीं पाए गए, और इस प्रकार मजबूत और मानकीकृत विधि के विकास के लिए एक की जरूरत को संबोधित किया गया था ।
नवजात चूहों के लिए विभिन्न यौगिकों के मौखिक प्रशासन के स्थापित तरीकों में गर्भवती बांधों के लिए पानी के स्रोत के इलाज के द्वारा दूध के माध्यम से वांछित यौगिकों के मातृ हस्तांतरण शामिल11 या प्रशासन की सुविधा के लिए सुई खिला का उपयोग oropharynx12में वांछित यौगिकों । इन पद्धतियों सटीक खुराक आवश्यकताओं और जहां उपचार आसानी से प्राप्तकर्ता माउस द्वारा किया जाता है नहीं है कि प्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं । प्रोबायोटिक्स अक्सर galactooligosaccharide और fructooligosaccharide (फोस) है कि प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के लिए पोषण के एक स्रोत के रूप में सेवा के रूप में एक prebiotic के साथ संयोजन के रूप में प्रशासित रहे हैं; इन additive यौगिकों समाधान चिपचिपा और इसके बाद के संस्करण का उल्लेख किया तरीके के माध्यम से प्रशासन को चुनौती देते हैं । जीवन के पहले दिन के रूप में शुरू करने के रूप में नवजात चूहों को प्रोबायोटिक्स और prebiotics की सटीक मात्रा प्रशासन के लिए एक विधि तैयार करना (राजभाषा) आवश्यक था । gavage तकनीक के विकास की प्रक्रिया में, औपनिवेशीकरण-प्रसार की संभावना (के रूप में उपचार और नियंत्रण शस्त्र13,14,15,16के बीच अंय प्रोबायोटिक अध्ययन में मनाया) परीक्षण और विभिंन gavage कार्यक्रम के साथ पिल्ले की आंतों में बृहदांत्र लैक्टोबैसिलस plantarum (एल. पी.) के सापेक्ष बहुतायत का आकलन किया गया था । प्रोबायोटिक तैयार प्रयोगों में इस्तेमाल किया 109 कॉलोनी बनाने इकाइयों (एल. पी. के gavage प्रति CFU) (ATCC-२०२१९५ तनाव), फोस (prebiotic) और माल्टोडेक्सट्रिन (excipient) के साथ मिश्रित के रूप में हाल ही में मानव परीक्षण3में वर्णित के शामिल हैं । प्रोबायोटिक डिलिवरी IE gavage का उपयोग कर पूरा किया गया था और इस प्रक्रिया के नीचे प्रोटोकॉल में विस्तृत है । प्रोबायोटिक के औपनिवेशीकरण प्रोफ़ाइल LP विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग पूरी आंतों से निकाले डीएनए के वास्तविक समय प्रवर्धन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था ।
IE gavage की प्रक्रिया को सुरक्षित रूप से नवजात चूहों के लिए एक प्रोबायोटिक की एक विशिष्ट खुराक प्रशासन के लिए विकसित किया गया था । तरल की छोटी मात्रा में ऊपरी जठरांत्र पथ को वितरित कर रहे है एक खिला सुई का उपयोग करने के लिए आकांक्षा को रोकने जबकि विश्वास में खुराक की डिलीवरी सुनिश्चित करने । चूहों की आंतों को औपनिवेशीकरण एनालिसिस के लिए दो और छह दिन पोस्ट gavage के लिए एकत्र किया गया. डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रक्रिया प्रोबायोटिक ग्राम पॉजिटिव जीव की उच्च उपज सुनिश्चित करने के लिए संशोधित किया गया था । डीएनए के qPCR विश्लेषण से दो दिन बाद निकाले गए पिछले gavage के चूहों 2-8 के बीच हर दिन gavaged चूहों की तुलना में हर दो दिन में एल पी एस के अपेक्षाकृत उच्च औपनिवेशीकरण दिखाया. वहाँ भी छह दिनों में एल पी की मात्रा में कमी आई, इस प्रोबायोटिक को दिखाते हुए चूहे की आंतों में एक क्षणिक जीव हो गया. इन प्रयोगों के परिणाम इस आयु वर्ग में उच्च कठोरता के साथ अनुसंधान का संचालन करने के लिए शर्तें स्थापित करते हैं ।
नवजात चूहों में प्रोबायोटिक्स के दीर्घकालिक प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए, यह डॉल 2 पर नवजात चूहों को प्रशासित किया गया था; मानव परीक्षण के लिए एक समान प्रारंभिक समय बिंदु । नवजात चूहों के Oropharyngeal खिला पहले साहित्य में वर्णित है और केवल एक अच्छी तरह से विकसित निगल यांत्रिकी के कारण आकांक्षा का खतरा कम है जब राजभाषा 5-812,17 के बाद किया गया है । हालांकि, oropharyngeal खिलाने की आकांक्षा की उच्च दर के रूप में डॉल 2 चूहों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है पायलट अध्ययन में देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । प्रोबायोटिक और prebiotic समाधान की चिपचिपा प्रकृति आकांक्षा के जोखिम को जोड़ा । IE gavaging प्रक्रिया के बाद राजभाषा 2 में आकांक्षा के जोखिम को कम चूहों जबकि ऊपरी जठरांत्र पथ के लिए सीधे वांछित मात्रा पहुंचाने । प्रक्रिया की सफलता पहले खाद्य रंग संचार प्रोबायोटिक gavage का उपयोग कर मांय किया गया था । एक मार्कर है कि पिल्ला की त्वचा के माध्यम से दिखाई दे रहा है के रूप में खाद्य रंग कार्य करता है । भोजन के रंग के साथ चूहों gavaged में कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं मनाया गया, और यह बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले इस तरीके से gavaging प्रक्रिया को मान्य करने के लिए सिफारिश की है. हांफते हुए पलटा देखी तेजी का संकल्प पोस्ट gavage भी एक सफल gavage के लिए एक अतिरिक्त संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार माउस हीटिंग कंबल के बाद gavage पर रखा गया है, हांफते पलटा उपपक्ष और श्वास आवृत्ति में वृद्धि 20 सेकंड के भीतर मनाया जाएगा । 30 सेकंड से अधिक समय के लिए हांफते पलटा की निरंतरता एक असफल gavage इंगित करता है । सफल gavage भी सही पेट के हृदय लुगदी के उद्घाटन के ऊपर बैठे बल्ब के साथ खिला सुई के उचित प्रविष्टि पर निर्भर करता है । यह सुनिश्चित करना है कि असिरूप प्रक्रिया और थूथन के टिप के बीच लंबाई मापने सुई पर अंकन, gavage के दौरान माउस के थूथन पिछले जाना नहीं है द्वारा सुविधा हो सकती है । यह माउस को चोट की संभावना को कम करता है । gavage की आवृत्ति प्रयोगात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । लगातार gavaging भी पिंजरे और घोंसले के लगातार गड़बड़ी के कारण पिल्ले और मां के लिए और अधिक तनाव पैदा कर सकता है । सबसे इष्टतम gavage अनुसूची है जब gavages कम बार कर रहे है और समय की एक छोटी अवधि पर प्रणाली में अपेक्षित प्रभाव खोने के बिना । इस प्रक्रिया की सुरक्षा और बांझपन सुनिश्चित करने के लिए gavage सुई धोने और autoclaving के बीच उपयोग के द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए । बाहर एक साफ़ और autoclaving से पहले एक सिरिंज का उपयोग कर सुई के माध्यम से पानी मजबूर द्वारा अंदर का उपयोग कर बाहर पर कड़ाई से धोने के रूप में आवश्यक है किसी भी बचे हुए कणों autoclaving के दौरान सुई पर अलंकृत कर सकते हैं और gavaging प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
उच्च एल. पी. औपनिवेशीकरण पिल्ले में मनाया गया है कि हर दूसरे दिन gavaged थे जब पिल्ले gavaged की तुलना में हर दिन । इस पिल्ले gavaged पर कम तनाव के कारण हो सकता है हर दूसरे दिन और संभवतः प्रोबायोटिक अपेक्षाकृत अधिक दूध के माध्यम से अधिक पोषक तत्वों हो रही इन पिल्ले द्वारा किया जाता है । प्रोबायोटिक उपचार की खुराक निर्भरता पहले माउस मॉडल में अध्ययन किया गया है18,19 और इस प्रकार सही खुराक के प्रशासन महत्वपूर्ण है. प्रोबायोटिक समाधान तैयार CFU प्रशासित की एक सटीक गिनती पाने के लिए हर gavage से पहले चढ़ाया जाता है । यदि प्रोबायोटिक जीव anaerobic है, यह देखने के लिए अगर वहां CFU में अंतर है जब प्रसंस्कृत एरोबिक या anaerobically महत्वपूर्ण है । के बाद से एल. पी. एक facultative anaerobe है, यह दोनों तरीकों का उपयोग कर संस्कृति और CFU में कोई फर्क नहीं देखा गया था ।
पोस्ट gavage आंत्र LP लोड विश्लेषण qPCR और उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूनों का उपयोग किया गया था । उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच LP डीएनए संदूषण को कम करने के लिए, विभिन्न खिला सुई, सुरक्षा अलमारियां और शल्य चिकित्सा उपकरण उच्चतम गुणवत्ता के नमूनों को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । आंत में प्रोबायोटिक की सटीक माप एक अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण विधि की आवश्यकता है । मल से डीएनए की निकासी के लिए सबसे कुशल तरीके कई मनका पिटाई कदम20,21,22शामिल है । यह विधि आंतों के निष्कर्षण के लिए अपनाया गया था मोतियों की धड़कन का उपयोग कर बैक्टीरिया और मनाया कम प्रतिनिधित्व (< 102 प्रतियां बरामद) एल पी एस की पूरी आंत डीएनए निष्कर्षण में. के रूप में LP सेल दीवार में peptidoglycan की एक पर्याप्त राशि के साथ एक ग्राम सकारात्मक जीव है, प्रोटोकॉल lysozyme23,24 एंजाइमी lysis बफर के लिए जोड़ा का उपयोग कर एक peptidoglycan विघटन कदम के साथ अनुकूलित किया गया था । यह दो गुना से अधिक से एक ही आंत्र नमूना में एल. पी. का प्रतिनिधित्व बढ़ा । lysozyme उपचार बाहरी परत के विघटन सुनिश्चित करता है, जबकि मनका धड़कन कदम जीव के lysis की सुविधा । ऊतक की राशि का अनुकूलन, गार्नेट मनका के प्रकार और विघटन की अवधि के मोतियों का उपयोग करने के लिए इष्टतम डीएनए उत्पादों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है पीसीआर विश्लेषण का संचालन ।
पूर्व अवधि और अवधि नवजात शिशुओं में प्रोफिलैक्सिस या उपचार के रूप में प्रशासित प्रोबायोटिक्स के सकारात्मक प्रभाव हाल के अध्ययन में सबूत है25,26,27,28. प्रोबायोटिक्स के लिए एक उचित नवजात माउस मॉडल की स्थापना के प्रोबायोटिक्स के सुरक्षात्मक प्रभाव खोलना वारंट है । इस प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित नवजात माउस काम प्रोबायोटिक्स का उपयोग कर के साथ अपरिचित शोधकर्ताओं के लिए एक गाइड का प्रतिनिधित्व करता है । मानव स्वास्थ्य और रोग का अध्ययन करते समय कुतर microbiota के साथ मुद्दों के बावजूद, इस विधि प्रोबायोटिक्स के कारण microbiome के परिवर्तन को समझने पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के लिए बढ़ाया जा सकता है । यह मॉडल भी विभिंन विकासात्मक चरणों के पाठ्यक्रम पर मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
पशु देखभाल सुविधा स्टाफ और प्रशिक्षण के लिए UBC पशुचिकित्सा और बीसी बच्चों के अस्पताल अनुसंधान संस्थान में माउस काम में सहायता करने के लिए धंयवाद । अध्ययन के वित्तपोषण के लिए ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय और प्रायोगिक चिकित्सा विभाग के लिए धंयवाद ।
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |